通过应激颗粒的形成揭示了苯扎氯铵和二癸基二甲基铵氯化物混合物的协同细胞毒性

《Toxicology》：Synergistic cytotoxicity of benzalkonium chloride and didecyldimethylammonium chloride mixtures revealed by stress granule formation

　　

金敏贞（Min-Jeong Kim）| 金恩美（Eun-Mi Kim）| 金基奎（Kee K. Kim）

韩国忠南国立大学自然科学学院生物化学系，大田，34134

摘要

苯扎氯铵（BAC）和十二烷基二甲基铵氯化物（DDAC）是季铵化合物（QAC）基的杀菌剂，被广泛用于各种商业消毒剂中，导致人类频繁同时接触这两种物质。尽管它们被普遍使用，但BAC和DDAC联合暴露所引起的毒性仍知之甚少。在这项研究中，我们使用实时应激颗粒（SG）形成作为亚致死细胞水平应激的敏感早期生物标志物，来探讨这些物质对人类肺腺癌细胞A549的影响。通过A549 G3BP1-eGFP敲入细胞，发现这两种化合物分别以时间和浓度依赖的方式诱导了SG的形成以及eIF2α的磷酸化，同时伴随着细胞活力的降低和H2O2水平的升高。在亚致死浓度下联合暴露显著增强了SG的组装，并以超出Bliss独立模型预测的水平协同抑制了细胞活力。在分子水平上，联合暴露强烈激活了多个未折叠蛋白反应（UPR）分支，包括PERK/eIF2α和IRE1α/XBP1信号通路，而单独处理仅部分激活了UPR。总体而言，这些发现表明BAC和DDAC的联合暴露通过内质网应激和氧化应激信号的协同放大作用诱导了毒性，并确立了SG形成作为检测常规检测方法无法捕捉到的细胞水平亚致死扰动的敏感生物标志物。这强调了基于混合物的消毒剂毒理学评估的必要性，并指出了当前评估单一化合物安全性的框架的局限性。

引言

季铵化合物（QACs）因其强大的抗菌活性和化学稳定性而被广泛用作消毒剂和防腐剂（Boyce, 2023; Lu et al., 2024）。从结构上看，QACs含有一个带正电的氮原子，与疏水性碳氢链相连，能够与带负电的微生物膜发生静电相互作用，从而破坏细胞完整性。在众多QAC变体中，选择苯扎氯铵（BAC）和十二烷基二甲基铵氯化物（DDAC）作为本研究的模型化合物，原因有以下几点：首先，它们是全球商业消毒剂中最常见的两种活性成分（Gerba 2015）。其次，它们在烷基链结构上有所不同：BAC含有一个长度可变的烷基链（C8–C18），而DDAC含有两个对称的癸基链，使其成为研究结构依赖性毒理相互作用的代表性组合。第三，这两种化合物单独使用时都会在哺乳动物上皮细胞中诱导快速、浓度依赖性的细胞毒性——这种反应与其两亲性和膜活性特性密切相关（Inacio et al., 2013; Kim et al., 2017; Prusek et al., 2025），这支持了它们作为急性消毒剂毒性模型的应用。

尽管QACs被广泛使用，但关于它们的毒理学研究主要集中在单一化合物的影响上（Kim et al., 2017; Prusek et al., 2025）。然而，在现实世界中，人类接触化学物质的情况很少是单独的，通常会暴露于多种化学物质的混合物中，这些混合物之间的相互作用可能会引发与单一化合物不同的细胞应激反应（Backhaus and Faust, 2012; Hora et al., 2020; Silva et al., 2002）。然而，BAC和DDAC的潜在协同毒性尚未得到系统研究。

传统的细胞毒性检测方法主要检测细胞损伤的后期阶段，可能会忽略低水平化学暴露引发的早期应激反应（Simmons et al., 2009; Viegas et al., 2022）。因此，需要敏感且准确的生物标志物来早期检测应激，以评估微妙的毒理学效应。应激颗粒（SGs）是由翻译应激和环境挑战迅速诱导的动态细胞质核蛋白组装体（Ivanov et al. 2019）。SG的形成通常与整合应激反应（ISR）的激活相关，特别是通过eIF2α的磷酸化，这是PERK介导的内质网（ER）应激等信号通路的下游过程（Pakos-Zebrucka et al., 2016; Sidrauski et al., 2015; Teske et al., 2011）。由于SGs在早期阶段形成，通过实时监测G3BP1-eGFP敲入细胞中的SG动态，可以敏感地检测到细胞应激反应，从而在出现明显细胞毒性之前发现应激（Cho et al., 2024a; Lee et al., 2024）。

在这项研究中，我们探讨了BAC和DDAC单独及联合暴露对人类肺上皮细胞应激反应的影响。我们使用SG形成作为早期应激的生物标志物，研究了即使在亚细胞毒性浓度下，BAC和DDAC的联合暴露是否也能协同诱导应激反应。进一步通过关注PERK-eIF2α和IRE1α-XBP1信号通路的激活来探讨其潜在的分子机制。这些发现为评估常用消毒剂的联合暴露潜在毒理学风险提供了新的见解，并强调了在混合物毒性评估中监测早期应激指标的价值。

章节片段

细胞培养

A549人类肺腺癌细胞系来自美国类型培养收集中心（Manassas, VA），并在Roswell Park Memorial Institute-1640培养基（RPMI-1640；Corning, NY, USA；Cat# 10-040-CV）中维持，培养基中添加了10%（v/v）胎牛血清（Gibco, Waltham, MA, USA；Cat# 12483-020）和1%（v/v）青霉素/链霉素（WELGENE, Gyeongsan, Korea；Cat# LS 202-02）。细胞在37°C、5% CO2的湿润培养箱中培养。当细胞密度达到80%–90%时……

BAC通过eIF2α磷酸化诱导SG形成，同时引起细胞毒性和氧化应激（OS）

BAC由一个苯基、两个甲基和一个长度可变的烷基链（n = 8–18）组成，这些基团连接到一个带正电的氮原子上（图1A）。用BAC处理A549 G3BP1-eGFP敲入细胞后，SG的形成随时间和浓度增加而增加。在6.5 μg/mL的亚细胞毒性浓度下未观察到显著效果，而15 μg/mL和30 μg/mL的BAC则显著诱导了细胞质中SG的组装（图1B）。定量分析显示……

讨论

本研究表明，BAC和DDAC的联合暴露在单独使用时无法产生任何可检测效应的浓度下，仍能引发明显的细胞应激反应，揭示了这两种广泛用于商业消毒剂的杀菌剂之间的协同毒性作用。使用G3BP1-eGFP敲入细胞系统能够实时可视化SG动态，作为敏感的早期生物标志物，捕捉到亚致死浓度下的应激反应……

伦理批准和参与同意

不适用。

作者声明没有已知的可能影响本文工作的利益冲突或个人关系。

资助

本研究得到了韩国环境技术研究院（KEITI）的支持，该研究属于韩国环境部（MOE）资助的家庭化学品安全管理技术开发项目（RS-2022-KE002021），以及首尔妇女大学的研究资助（2026-0117）。

金基奎（Kee K. Kim）：撰写 – 审稿与编辑、可视化、监督、项目管理、研究、资金获取、概念构思。金敏贞（Min-Jeong Kim）：撰写 – 初稿撰写、可视化、软件使用、方法学设计、研究实施、数据分析。金恩美（Eun-Mi Kim）：研究实施、资金获取、数据分析、概念构思。

作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。