《Toxicology》：MEHP exposure disrupts the self-renewal and differentiation of GC-1 cells by up-regulating m6A levels, leading to reproductive damage in immature rats
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丁彦军|周夏珠|洪一凡|陈静|唐浩辉|孙斌荣|龙春兰|沈连菊|吴胜德|魏月新|魏光辉重庆医科大学儿童医院泌尿科，国家儿童健康与疾病临床研究中心，教育部儿童发展与疾病重点实验室，中国重庆400014摘要邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）及其活性代谢物邻苯二甲酸单(2-乙基己
丁彦军|周夏珠|洪一凡|陈静|唐浩辉|孙斌荣|龙春兰|沈连菊|吴胜德|魏月新|魏光辉
重庆医科大学儿童医院泌尿科，国家儿童健康与疾病临床研究中心，教育部儿童发展与疾病重点实验室，中国重庆400014
摘要
邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）及其活性代谢物邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯（MEHP）是环境内分泌干扰物，与男性生殖毒性有关，但其潜在机制尚不清楚。本研究通过体内未成熟大鼠DEHP暴露模型和体外MEHP处理的GC-1细胞，探讨了N6-甲基腺苷（m6A）修饰是否参与了DEHP/MEHP诱导的生殖损伤。在体内实验中，DEHP暴露导致未成熟大鼠睾丸损伤，包括生精小管结构紊乱以及生精上皮高度和管径减小。在体外实验中，MEHP增加了细胞内的m6A水平，改变了细胞周期分布，并干扰了GC-1细胞中与自我更新和分化相关的标记物的表达。MeRIP-seq分析进一步显示，MEHP暴露后m6A峰值增加，与细胞周期相关的通路富集。在检测的m6A调节因子中，YTHDF1在MEHP处理后显著上调。此外，YTHDF1敲低可逆转MEHP诱导的自我更新和分化相关蛋白的异常表达。这些发现表明，m6A修饰的失调（可能涉及YTHDF1）参与了DEHP/MEHP诱导的男性生殖损伤。
引言
全球约有9%的育龄夫妇受到不孕症的影响，其中50%的病例由男性因素导致（Eisenberg等人，2023年）。男性不孕症可能由多种原因引起，包括遗传异常、药物使用和环境暴露（Fainberg和Kashanian，2019年）。越来越多的研究表明，某些环境物质可以通过干扰内分泌系统导致男性不孕（Mari?等人，2021年；Selvaraju等人，2021年）。邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）是一种常用的增塑剂，广泛应用于食品和饮料包装、化妆品及其他消费品中。它已被确认为内分泌干扰物（Manikkam等人，2013年）。DEHP可通过饮食摄入、吸入和皮肤接触等多种途径进入人体，随后对多个器官系统造成损害（Andersen等人，2018年；Gao等人，2023年；Hopf等人，2014年）。基于生物监测的评估表明，DEHP暴露在普通人群中普遍存在，美国普通人群的平均每日总摄入量约为1–30 μg/kg体重（美国有毒物质和疾病登记署，2022年）。在欧洲人群中，普通人群的估计暴露量为0.9–7.2 μg/kg体重/天，高暴露组为1.6–11.7 μg/kg体重/天（Silano等人，2019年）。此外，DEHP仍是一种受监管关注的化学物质；美国环境保护署（EPA）最近的风险评估强调了在特定职业和环境暴露情景下其潜在风险，进一步凸显了对其健康影响进行持续研究的必要性（美国环境保护署，2025年）。
DEHP暴露与男性生殖损伤密切相关。大量研究表明，DEHP暴露会损害男性精子质量（Chang等人，2017年）。一些研究考察了DEHP暴露后男性生殖激素的变化，例如睾酮合成受到干扰（Pan等人，2015年）。此外，体外实验还研究了邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯（MEHP）造成的损伤，这是DEHP在体内的主要代谢物。例如，MEHP暴露会导致TM4和TM3细胞线粒体损伤和氧化应激（Wang等人，2024年）。MEHP会抑制GC-1细胞的活力，并诱导细胞周期停滞和凋亡（Zhou等人，2023年）。然而，DEHP损害男性生殖系统的具体机制尚未完全明了。
作为一种动态RNA修饰，m6A在许多疾病中是基因表达的关键调节因子（Mathiyalagan等人，2019年；Qiao等人，2021年）。m6A修饰由三种类型的分子共同作用介导：甲基转移酶（写入者）、去甲基酶（擦除者）和结合蛋白（读取者）。具体来说，甲基转移酶包括METTL3、METTL14和METTL16；去甲基酶包括FTO和ALKBH5；结合蛋白包括YTH和HNRNP家族（He等人，2019年）。多项研究表明，m6A RNA甲基化调节因子与MEHP诱导的男性生殖损伤有关。例如，FTO去甲基酶介导的m6A修饰参与了MEHP诱导的莱迪希细胞损伤（Zhao等人，2021年）。在GC-2细胞中，m6A可以减轻DEHP的基因毒性（Fu等人，2023年）。然而，m6A参与MEHP诱导的GC-1细胞损伤的机制仍不完全清楚。
男性生殖细胞的发育涉及复杂的分化过程。在多种因素的调控下，精原干细胞逐渐分化为精原细胞，然后是精细胞，最终形成成熟的精子。精原细胞分化和去分化的平衡对于维持正常的精子发生至关重要（Griswold，2016年）。因此，本研究旨在探讨m6A修饰是否参与了DEHP诱导的睾丸毒性，并阐明MEHP对GC-1细胞自我更新和分化的影响，从而为治疗男性不孕提供新的靶点。
章节摘录
动物
本研究中使用的实验动物方案获得了重庆医科大学实验动物伦理委员会的批准（实验动物生产许可证编号：SYXK (Yu) 2020-0001），并符合中国实验室动物护理评估与认证协会制定的指南。
实验中使用的30只20日龄的雄性Sprague-Dawley大鼠购自重庆医科大学实验动物中心
DEHP暴露导致未成熟大鼠睾丸损伤
为了观察DEHP引起的生殖毒性，本研究建立了未成熟大鼠的DEHP暴露模型。DEHP的剂量基于我们之前的研究确定（Zhou等人，2024年）。尽管这些剂量远高于人类的日常暴露水平，但它们有助于探索实验条件下DEHP诱导的生殖毒性的潜在机制。
DEHP暴露后，未成熟大鼠睾丸中的生精小管
讨论
DEHP在日常生活和生产中广泛使用，如玩具、饮料包装、化妆品和塑料制品制造（Erythropel等人，2014年；Huang等人，2018年；Souza等人，2022年）。人类经常通过皮肤接触、食物摄入和呼吸道吸入暴露于DEHP（Bek?等人，2015年；Gong等人，2016年；Ji等人，2014年）。DEHP及其代谢物MEHP已被证实是环境内分泌干扰物，与男性生殖系统密切相关
结论
本研究探讨了m6A修饰在DEHP/MEHP诱导的男性生殖损伤中的作用。在体内实验中，DEHP暴露导致未成熟大鼠生精小管结构紊乱和睾丸损伤。在体外实验中，MEHP增加了GC-1细胞中的m6A水平，并改变了检测的m6A相关调节因子中的YTHDF1表达。MeRIP-seq和流式细胞术分析表明，MEHP暴露与细胞周期调控和RNA转运通路的变化有关。
CRediT作者贡献声明
丁彦军：正式分析、研究方法、撰写 - 原稿撰写、审稿与编辑。周夏珠：正式分析、研究方法、撰写审稿与编辑。洪一凡：研究方法、撰写 - 审稿与编辑。陈静：资源和数据管理。唐浩辉：研究方法和数据管理。孙斌荣：数据管理。龙春兰：研究方法指导。沈连菊：研究方法指导。吴胜德：资金获取、监督、撰写 - 审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了重庆市自然科学基金的博士后科学基金项目（编号：CSTB2023NSCQ-BHX0118）的支持。
ARRIVE声明
本研究遵循ARRIVE 2.0指南进行，所有动物实验均获得了重庆医科大学动物护理和使用委员会的批准（批准编号：CHCMU-IACUC20211222001）。本手稿中所有动物实验的报告严格遵循ARRIVE 2.0指南。
