用于自由活动秀丽隐杆线虫自然行为及细胞活动成像的落射荧光显微镜设计

《Nature Communications》：An epifluorescence microscope design for naturalistic behavior and cellular activity in freely moving Caenorhabditis elegans

　　

理解行为的神经基础需要对自由活动动物的细胞活动进行成像，而这通常需要昂贵且限制性的显微镜装置。为突破这些障碍，研究人员开发了Wormspy——一种低成本、开源的落射荧光显微系统，用于对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）进行高倍率成像与追踪。Wormspy可在无需固定动物的情况下，同步记录神经元活动与行为动态。研究人员展示了该系统在体壁肌肉、感觉神经元以及中间神经元轴突内亚细胞钙事件成像中的应用。该平台能够复现已知的突变体表型，并在现有认知范围内揭示了此前无法获取的感觉运动相关性。研究表明，Wormspy提供了一个稳健、模块化的框架，降低了高分辨率神经成像的技术门槛，支持灵活的实验设计，可用于解析自由活动生物体的行为机制。

研究背景方面，解析行为的神经基础需要在接近自然的条件下对活体动物进行细胞水平成像。秀丽隐杆线虫（C. elegans）因其体型微小、透明及成熟的遗传工具，成为神经生物学研究的理想模型。近年来，开源硬件与数字制造技术的发展推动了定制化科研仪器的普及，但在自由活动线虫中实现高分辨率荧光成像仍面临挑战。现有平台主要分为两类：一类注重大视场行为追踪，但缺乏单细胞分辨率；另一类采用高倍物镜观察细胞活动，却限制了动物的自然行为谱。双光子共聚焦系统虽能实现全脑成像，但设备昂贵、操作复杂，且依赖压电平台移动样品，产生的振动会影响线虫的自然行为，同时难以捕捉轴突等亚细胞结构的动态活动。因此，研究人员亟需开发一种紧凑、灵活且低成本的解决方案。

为开展此项研究，研究人员采用了多项关键技术方法。核心装置包括模块化设计的Wormspy落射荧光光路，搭载于电动位移平台上，使用7.5倍物镜提供1440×900 μm视场，适配成虫体长。硬件集成双色LED激发光源与双通道相机，分别采集绿色荧光蛋白（如GCaMP）与红色参考信号。软件系统基于Python与OpenCV开发，支持三种追踪模式：明场阈值追踪、荧光标记追踪及DeepLabCut（DLC）深度学习追踪，并配备基于拉普拉斯方差的自动对焦（FocusLock）功能。实验样本为不同转基因品系的同步化年轻成虫，包括体壁肌肉表达GCaMP3的品系、ASH感觉神经元共表达GCaMP6f与DsRed的品系、AWC^ON感觉神经元表达GCaMP5的品系，以及RIA中间神经元表达GCaMP6f的品系。数据分析采用自定义图像处理流程，结合Segment Anything Model 2（SAM2）进行亚细胞区室分割。

研究结果部分如下：

显微镜设计：Wormspy采用单光路双通道成像结构，通过电动位移平台移动显微镜而非样品，避免了传统平台移动带来的机械振动干扰。系统支持灵活更换滤光片与物镜，可适配钙成像、光刺激等多种实验需求。

软件设计与用户界面：软件界面集成实时视频流显示、手动/自动追踪切换、对焦锁定及数据录制功能。支持无损16位TIFF堆栈与压缩AVI格式存储，确保荧光定量分析与行为学分析的兼容性。

自由活动动物体壁肌肉细胞钙成像：研究人员对野生型与gar-3突变体线虫进行同步成像，通过中线骨架分割算法将身体划分为28个区域，定量分析背腹侧体壁肌肉的钙动态。结果显示突变体表现出更大的体弯幅度与头部摆动角度，且运动频率降低，验证了Wormspy在运动表型量化中的可靠性。

多模态ASH感觉神经元钙成像：在高渗甘油屏障实验中，研究人员采用双色比率成像校正运动伪影。数据经Two-channel Motion Artifact Correction算法处理后，成功捕捉到ASH神经元在动物接触刺激物并发生后退行为前的钙信号显著升高，与文献报道一致。

食物斑块导航中AWC^ON感觉神经元钙成像：针对食物背景下的追踪难点，结合手动与自动模式，记录到AWC^ON神经元在线虫离开食物斑块时钙活动增强，证实了该平台在复杂环境下的适用性。

RIA轴突区室钙成像：利用高时空分辨率成像，研究人员在单个平面内同时分辨RIA轴突的腹侧（nrV）与背侧（nrD）区室。通过头角度与钙信号的相位分析，发现nrV与nrD的钙瞬变分别与腹侧、背侧头部弯曲速度峰值同步，揭示了在自由活动状态下神经元活动的精确时序特征，与固定状态下的数据存在差异。

讨论与结论部分指出，Wormspy通过低成本开源设计，有效解决了自由活动小动物细胞成像的技术壁垒。该系统在保持动物自然行为的同时，实现了从肌肉细胞到单一神经元乃至轴突亚区的高分辨率钙成像。相比昂贵的商业共聚焦系统，Wormspy的模块化设计便于功能扩展，如集成光遗传学刺激模块，并可推广应用于果蝇幼虫等其他小型模式生物。该研究不仅提供了表征神经活动与行为关联的新工具，也为行为神经科学领域的开放硬件发展提供了重要参考。论文发表于《Nature Communications》，标志着这一技术在神经成像领域的认可与应用潜力。