可溶性尿酸抑制脓毒症中中性粒细胞介导的宿主防御

《Nature Communications》：Soluble uric acid suppresses neutrophil-mediated host defense in sepsis

　　

中性粒细胞对于宿主防御和炎症至关重要，然而其中性粒细胞功能障碍是肾病中获得性免疫缺陷的一个标志，导致腹膜炎、脓毒症和肺炎等感染易感性增加。研究人员推测，代谢物可溶性尿酸（sUA，soluble uric acid）的肾脏清除受损是中性粒细胞功能障碍的原因。事实上，与肾病相关或无关的高尿酸血症（HU，血清UA为9–14 mg/dL）显著加剧了内毒素血症和细菌性脓毒症小鼠的炎症性免疫反应。尽管促进高炎症，HU同时损害宿主防御，这种效应可通过使用非布司他（febuxostat）降低UA水平而部分逆转。研究人员在体外使用来自健康个体或伴慢性肾病的高尿酸血症患者的中性粒细胞或血清验证了这些发现。耗竭UA可部分恢复中性粒细胞功能。在机制上，sUA促进中性粒细胞活化和脱颗粒，但损害吞噬作用，导致NOX2（NADPH氧化酶2）表达降低，且这一过程不依赖于细胞内MPO（髓过氧化物酶）水平。这导致人类中性粒细胞中活性氧（ROS）产生减少和细菌清除缺陷。相反，在暴露于LPS或大肠杆菌（E.coli）后，sUA对中性粒细胞胞外诱捕网（NET）的形成无影响。总之，研究结果确定HU是一种免疫代谢调节因子，其放大高炎症，同时损害有效的宿主防御，表明靶向UA可能有助于克服肾病中的获得性免疫缺陷。

研究背景：感染（如COVID-19、脓毒症、肺炎等）每年影响数百万人并伴有高死亡率。在肾病患者中，感染并发症是第二大死亡原因。肾病（尤其是透析患者）由于肾病相关的继发性免疫缺陷（SIDKD，secondary immunodeficiency related to kidney disease）面临增加的感染风险和差的疫苗反应。尿毒症溶质/代谢物和免疫调节蛋白（如吲哚硫酸盐、瘦素、成纤维细胞生长因子23）驱动不受控制的炎症和中性粒细胞功能障碍。中性粒细胞功能障碍包括吞噬病原体能力降低、呼吸爆发减少、迁移改变以及NET释放和NETosis减弱。近期证据表明，代谢物可溶性尿酸（sUA，即无症状高尿酸血症HU，多数CKD患者存在）损害β2整合素活化和内化/再循环，从而改变无菌炎症期间的中性粒细胞迁移。然而，sUA介导的免疫功能障碍是否损害肾病中感染时的宿主防御仍不清楚。研究人员假设HU影响CKD内毒素血症和细菌性脓毒症期间的中性粒细胞效应功能，即sUA抑制中性粒细胞吞噬、细菌清除和氧化爆发。本研究旨在证明CKD相关的HU和细胞内sUA驱动高炎症，同时抑制中性粒细胞抗菌功能而不影响NET释放，表明sUA介导的中性粒细胞功能障碍可能促成SIDKD。

关键技术方法：研究人员使用了转基因小鼠模型（Alb-creERT2;Glut9^lox/lox和Glut9^lox/lox对照小鼠，喂食富含肌苷的饮食以诱导无症状HU伴或不伴CKD），建立内毒素血症（LPS诱导）、革兰氏阳性脓毒症（PEP诱导）和多微生物脓毒症（盲肠结扎穿刺CLP诱导）模型；使用非布司他（febuxostat，黄嘌呤氧化酶抑制剂，ULT）进行降尿酸治疗；从健康个体和CKD/ESKD患者（队列来源：CKD G2-4期非透析患者8例，ESKD G5D期血液透析患者4例，健康对照10例）分离人血中性粒细胞进行体外实验；应用流式细胞术、ELISA、RNA测序（bulk RNA-seq）、荧光显微镜、细菌杀伤测定、ROS/超氧化物检测、吞噬测定（pHrodo E.coli Bioparticles、IgG-FITC微球、Dextran）、NET形成测定、qPCR以及rasburicase（尿酸氧化酶）或febuxostat处理以操纵sUA水平；统计学分析采用单因素/双因素ANOVA。

研究结果：

Hyperuricemia amplifies the inflammatory response during LPS-induced endotoxemia and bacterial sepsis in mice（高尿酸血症放大小鼠LPS诱导的内毒素血症和细菌性脓毒症期间的炎症反应）：研究人员通过转基因小鼠模型（无症状HU，血清UA 9–14 mg/dL）发现，HU小鼠在LPS或CLP后显示受损的肾功能（血浆肌酐升高）、更高的血浆IL-6水平、增加的血和腹膜中性粒细胞计数、更高腹膜IL-6水平以及脾中性粒细胞数量，并且在CLP后腹膜灌洗液细菌生长更高、肾内动脉血管闭塞更严重。使用febuxostat降UA治疗显著降低血清UA和肌酐、减轻炎症（更低血浆/腹膜IL-6）并减少血、腹膜和脾中性粒细胞计数。表明无症状HU不加肾功能障碍加剧LPS内毒素血症和细菌性脓毒症，驱动全身炎症，并可被ULT部分缓解。

CKD-related HU aggravates the immune response in LPS-induced endotoxemia and gram-positive sepsis in mice（CKD相关的HU加重小鼠LPS诱导的内毒素血症和革兰氏阳性脓毒症中的免疫反应）：在HU伴CKD小鼠中，LPS或PEP后血浆IL-6、血中性粒细胞和单核细胞计数显著增加；流式细胞术显示血中性粒细胞CXCR4和CD62L表面表达降低，CXCR2表达增加，提示CKD相关HU促进中性粒细胞活化和趋化；腹膜IL-6和IL-1β更高，中性粒细胞、巨噬细胞和单核细胞计数更多；各组中无UA结晶。febuxostat降UA显著降低血清UA/肌酐、炎症（更低IL-6）、血/腹膜中性粒细胞计数，并改变中性粒细胞表面标志物（更高CD62L/CXCR4 MFI，更低CXCR2），减少脾中性粒细胞积聚。类似结果见于PEP模型。表明CKD相关HU通过促进中性粒细胞活化和招募，加重LPS内毒素血症和PEP革兰氏阳性脓毒症的炎症反应，可被ULT部分缓解。

CKD-related hyperuricemia worsens the outcomes during bacterial sepsis in mice（CKD相关高尿酸血症恶化小鼠细菌性脓毒症期间的结果）：在HU伴CKD小鼠CLP模型中，CLP未进一步升高血清UA/肌酐，而健康小鼠CLP后肾功能下降；HU伴CKD小鼠CLP后血浆IL-6更高、血中性粒细胞和单核细胞更多、中性粒细胞CD62L/CXCR4降低且CXCR2升高；腹膜细菌负荷更高、腹膜IL-6/IL-1β更高、腹膜和脾脏免疫细胞和MPO水平更高、肾内动脉血管闭塞更重；无UA结晶。表明CKD相关HU通过促进细胞活化、细胞因子释放、肾免疫血栓和中性粒细胞招募诱导高炎症，同时损害病原体清除。

Urate lowering therapy diminishes the outcomes in bacterial sepsis in mice（降尿酸疗法减轻小鼠细菌性脓毒症的结果）：在HU伴CKD小鼠CLP前用febuxostat治疗，降低血清UA/肌酐、降低血浆IL-6（无统计学显著性）、增加血中性粒细胞计数且不改变其CD62L/CXCR4但降低CXCR2；减少CLP后细菌负荷、腹膜IL-6、增加腹膜中性粒细胞、降低腹膜MPO和肾血栓。表明febuxostat通过减少炎症反应和改善宿主防御（减少细菌负荷）改善高尿酸血症CKD小鼠脓毒症结果。

Soluble uric acid alters gene expression, activation and maturation in human neutrophils（可溶性尿酸改变人中性粒细胞的基因表达、活化和成熟）：人健康中性粒细胞经sUA（10 mg/dL）处理后，流式细胞术显示CXCR2和CD101表面表达增加，CD62L降低，CXCR4不变；细胞大小（FSC）减小，颗粒度（SSC）和细胞内CD66b（脱颗粒标志）改变，提示sUA促进活化、脱颗粒和更成熟表型。RNA-seq显示sUA下调炎症和粘附相关转录本（如PTGS2、EGR1、CXCL5、ITGB），上调rRNA过程、DNA复制、线粒体代谢、核糖体生物发生、能量产生（ATP/NADH）等；GO和GSEA显示sUA改变多种生物学过程，包括增强促炎信号、生物合成和代谢活性、受体反应性，可能导致中性粒细胞活化但功能障碍。

Soluble UA impairs phagocytosis and bacterial killing in human neutrophils（可溶性UA损害人中性粒细胞的吞噬和杀菌作用）：sUA预孵育人中性粒细胞后，吞噬Dextran和pHrodo E.coli Bioparticles的能力降低，类似细胞松弛素D（CytD，吞噬抑制剂）效应；sUA也减少吞噬E.coli和杀菌能力（更高E.coli CFU/μl），类似DPI（NOX抑制剂）和CytD但不像4-ABAH（MPO抑制剂）。febuxostat不降低细胞外UA但rasburicase耗竭sUA；sUA增加细胞内sUA，febuxostat不改变但rasburicase降低之；sUA改变表面标志（CXCR2不变、CD62L降低、CXCR4不变、CD101增加），febuxostat类似sUA，rasburicase逆转吞噬能力至对照水平。sUA不影响NET形成（LPS/fMLP/E.coli刺激）。表明sUA损害中性粒细胞吞噬和杀E.coli能力，而NET形成保持完整。

Soluble UA diminishes oxidative burst in human neutrophils（可溶性UA减少人中性粒细胞的氧化爆发）：sUA预孵育后，PCN（超氧化物/ROS诱导剂）诱导的ROS产生显著降低；LPS/fMLP不增加ROS但sUA预孵育显著降低ROS；流式细胞术显示sUA降低激活和非激活中性粒细胞的细胞内ROS；DPI（NOX抑制剂）或4-ABAH（MPO抑制剂）无额外抑制；sUA降低NOX2（Cybb）和TLR4 mRNA表达，p38a、XDH、JNK1不变；sUA降低黄嘌呤氧化酶活性，不影响细胞内MPO表达；febuxostat降低细胞内ROS类似sUA，rasburicase逆转；sUA降低E.coli存在下的ROS，类似NOX、MPO和吞噬阻断。表明sUA通过TLR4和NOX2损害人中性粒细胞氧化爆发，不影响细胞内MPO表达，提示细胞内sUA影响ROS依赖性吞噬和病原体清除。

Neutrophil phagocytosis and oxidative burst are impaired in hyperuricemic patients（吞噬和氧化爆放在高尿酸血症患者中受损）：来自CKD和ESKD患者的中性粒细胞显示CD62L表面表达降低，CXCR2/CXCR4不变；FSC-H增加（更大细胞大小），SSC-H和 intracellular CD66b降低（脱颗粒）；吞噬IgG-FITC微球能力降低；用CKD患者血清（高sUA）预孵育健康人中性粒细胞降低其吞噬微球和产生ROS但不影响超氧化物，rasburicase耗竭sUA逆转之。确认sUA损害高尿酸血症CKD患者中性粒细胞的吞噬和ROS生成。

讨论部分总结：研究人员曾假设HU影响内毒素血症和细菌性脓毒症期间的中性粒细胞功能，尤其在肾病背景下。体内和体外结果支持该观点，表明CKD相关的HU和细胞内sUA广泛驱动高炎症，同时抑制中性粒细胞效应功能，包括吞噬、杀菌和ROS生成，这些效应不影响NET释放，但似乎涉及细胞骨架动力学、细胞老化和脱颗粒变化。数据表明sUA介导的中性粒细胞功能障碍可能促成SIDKD。肾病是COVID-19和其他严重感染（包括脓毒症）不良结局和死亡率增加的危险因素；SIDKD机制包括肠屏障功能障碍、慢性炎症、肠 microbiota secretome改变、免疫麻痹因免疫调节蛋白和代谢物的尿液清除受损，损害免疫细胞功能。中性粒细胞功能障碍常见于SIDKD；HU相关或不相关CKD已知抑制无菌炎症（如痛风性关节炎）的中性粒细胞招募，但本研究揭示了感染期间HU的不同情境依赖作用：HU通过在小鼠中增加促炎细胞因子水平、中性粒细胞计数和活化、细菌负荷和免疫血栓来加剧内毒素血症和细菌性脓毒症的高炎症反应，这些效应可被febuxostat ULT部分逆转。类似糖尿病等代谢疾病损害中性粒细胞趋化、吞噬和ROS产生，恶化脓毒症结局。sUA对细菌感染期间免疫细胞功能的影响此前知之甚少；本研究首次报告细胞内sUA促成体外人中性粒细胞功能障碍，与肾病患者中性粒细胞功能障碍一致，指向清除细菌病原体的免疫反应减弱。这种损害可能源于改变的细胞骨架动力学、TLR4和NOX2表达下调以及黄嘌呤氧化酶活性降低导致的ROS产生减少。sUA似乎干扰无菌炎症期间的过程，与其他尿毒症相关免疫调节蛋白/代谢物类似，但这可能是疾病或刺激依赖的，因为在CKD高尿酸血症小鼠和患者中血液更高比例中性粒细胞（CD62L^low、CXCR4^low、CXCR2^high）提示更高比例活化和动员的中性粒细胞。虽然脓毒症通常关联循环中青年CD62L^high和未成熟CXCR2^low中性粒细胞（紧急粒系生成），驱动ROS生成和杀菌物质释放，但CKD相关HU和sUA似乎通过促进中性粒细胞活化和脱颗粒促炎，同时损害脓毒症中中性粒细胞的抗菌能力。UA可与MPO相互作用，形成尿酸-MPO反应产物并在氧化爆发期间消耗UA；UA也可作为过氧亚硝酸盐和其他活性氮物质的清除剂，限制MPO和NADPH氧化酶介导的氧化反应，可能解释sUA处理的中性粒细胞中ROS产生减少但不影响超氧化物和细胞内MPO表达，因为尿酸可能淬灭呼吸爆发期间产生的氧化剂或通过对氧化还原反应的MPO活性修饰；这些效应可能防护过度氧化组织损伤，但同时可能在HU和CKD期间削弱中性粒细胞抗菌能力。NETs对病原体控制至关重要，但过度NET形成可驱动炎症、免疫血栓和器官损伤；在CLP诱导的脓毒症小鼠中，CKD相关HU观察到成熟中性粒细胞积累增加、MPO水平升高和肾免疫血栓；成熟中性粒细胞已知在小鼠中显示增加NET形成；但本研究体外数据显示细胞内sUA促进健康个体和患者中性粒细胞脱颗粒，而NADPH氧化酶依赖的NET形成不受影响；需要进一步研究不成熟和成熟中性粒细胞在此背景下对NET形成的贡献。本研究局限性包括CLP模型可变异性、rasburicase降解UA产生过氧化氢（但未观察到人中性粒细胞氧化应激增加）、未将抗生素纳入CLP模型（粪便细菌对多微生物脓毒症诱导必要）。总之，研究结果确定了HU在内毒素血症和细菌性脓毒症中的免疫调节作用，尤其在CKD中，sUA驱动高炎症（特征为细胞因子水平增加、中性粒细胞活化和招募），同时抑制宿主防御（抑制中性粒细胞效应功能包括吞噬、杀菌和ROS生成）；特别是sUA破坏吞噬偶联的NOX2-脱颗粒轴，TLR4信号减少吞噬活化，导致NOX2表达和脱颗粒减少，造成细菌杀伤所需的ROS产生不足；这些缺陷可能促成SIDKD；通过将CKD相关的代谢紊乱与先天免疫功能障碍联系起来，研究结果为HU如何在感染期间损害免疫能力提供了新见解；用ULT纠正HU可提供策略以减轻肾病中感染相关并发症。

研究结论翻译：总体而言，研究结果确定了HU在内毒素血症和细菌性脓毒症中的免疫调节作用，尤其在CKD中，sUA驱动高炎症，其特征为细胞因子水平增加、中性粒细胞活化和招募，同时抑制宿主防御，抑制中性粒细胞效应功能包括吞噬、细菌杀伤和ROS生成。特别是，sUA破坏吞噬偶联的NOX2-脱颗粒轴，其中TLR4信号减少吞噬活化，导致NOX2表达和脱颗粒减少，造成细菌杀伤所需的ROS产生不足。这些缺陷可能促成SIDKD。通过将CKD相关的代谢紊乱与先天免疫功能障碍联系起来，研究结果为HU如何在感染期间损害免疫能力提供了新见解。用ULT纠正HU可提供策略以减轻肾病中感染相关并发症。