《Microbiology Spectrum》：Comparative evaluation of three commercial real-time PCR kits for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex and non-tuberculous mycobacteria from pulmonary and extrapulmonary clinical samples: experiences from a low-income and high-burden setting
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准确及时地检测结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC）与非结核分枝杆菌（non-tuberculous mycobacteria, NTM）仍是诊断领域的挑战，尤其在肺外样本与低资源环境中。研究人员
准确及时地检测结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC）与非结核分枝杆菌（non-tuberculous mycobacteria, NTM）仍是诊断领域的挑战，尤其在肺外样本与低资源环境中。研究人员旨在评估并比较三种商用实时聚合酶链式反应（real-time polymerase chain reaction, PCR）检测试剂盒——VIASURE MTBC+NTM实时PCR检测试剂盒（“Viasure”）、分枝杆菌多重核酸检测试剂盒（“Sansure”）及Anyplex MTB/NTMe实时检测试剂盒（“Seegene”）——与传统诊断方法（涂片镜检与培养）在肺及肺外样本中检测MTBC与NTM的临床性能。研究共纳入407份疑似结核病或其他分枝杆菌病患者的临床样本，所有样本均行涂片镜检、分枝杆菌培养及三种实时PCR检测。首先，研究人员将各试剂盒分别与涂片、培养单独比较（方案1）；其次，采用复合参考标准（composite reference standard, CRS），即任一检测阳性即判定为阳性，评估涂片、培养及三种PCR对MTBC与NTM的检测性能（方案2）；第三，以Seegene为参照，排除Ct≥35的PCR阳性结果，聚焦高置信度结果进行比较（方案3）。总体阳性率最低为涂片（14.8%；41/278）与培养（32.7%；48/147），居中者为Sansure（18.7%；52/278），最高为Viasure（60.1%；167/278）与Seegene（53.2%；148/278），且在肺与肺外样本中趋势一致。方案1中，以涂片或培养为参照，Viasure与Seegene灵敏度高但特异度中等，这实际归因于参照方法的临床性能不足。方案2的CRS框架下，涂片与培养仅分别检出约20%与46%的CRS阳性病例，而Viasure与Seegene覆盖了大部分MTBC感染（总MTBC灵敏度分别为0.73与0.71）。在方案1与2中，Sansure检测MTBC的灵敏度显著低于其余试剂盒。针对NTM，Viasure显著优于其余试剂盒（总灵敏度0.88；特异度0.98），而Sansure与Seegene虽特异度接近完美，但NTM灵敏度极低（分别为0.19与0.13）。方案3中，限定Ct<35并以Seegene为参照，试剂盒间MTBC一致性极高：Viasure灵敏度更高（0.97）但特异度略低（0.89），Sansure灵敏度较低（0.84）但特异度几乎完美（0.99）；该方案中因应用Ct过滤后Seegene NTM阳性稀缺，无法可靠评估NTM性能。研究结果表明，Viasure与Seegene在肺及肺外标本中对MTBC的检测均显著优于涂片镜检与培养，其中Viasure整体平衡性最佳且NTM检测优势明显。Sansure特异性强但灵敏度不足，相较传统方法新增诊断贡献有限。在中高负担地区，快速准确区分临床样本中的结核病与NTM至关重要，研究结果支持将高灵敏度PCR检测（尤其是Viasure与Seegene）作为诊断流程的核心工具，辅以培养用于药物敏感性试验与全物种鉴定。
本研究发表于《Microbiology Spectrum》，聚焦于低收入高负担地区肺及肺外样本中分枝杆菌检测的优化需求。结核病（tuberculosis, TB）由结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC）引起，仍是全球发病与死亡的主要病因之一，2023年全球新发感染者约1080万例，达世界卫生组织（World Health Organization, WHO）自1995年监测以来的峰值。厄瓜多尔结核病发病率较2015年上升47%，防控形势严峻。非结核分枝杆菌（non-tuberculous mycobacteria, NTM）为环境中广泛存在的分枝杆菌，部分物种可致肺、肺外及播散性感染，且随免疫受损人群扩大呈上升趋势，已成为新兴公共卫生问题。早期精准鉴别MTBC与NTM是启动有效治疗、阻断传播的核心，但传统方法存在显著局限：抗酸杆菌（acid-fast bacilli, AFB）涂片镜检灵敏度低，尤其对菌量少及HIV感染者；分枝杆菌培养虽为金标准，但耗时长、资源消耗大，且无法仅凭生长结果实现种水平区分。商用实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）检测可提升灵敏度与特异度、缩短周转时间，但不同试剂盒在低资源环境下的性能差异尚缺乏系统评估。为此，研究人员针对厄瓜多尔临床场景，比较三种本地可及的商用qPCR试剂盒与传统方法的诊断效能，填补相关验证空白。
研究采用回顾性比较设计，关键技术方法包括：构建包含407份临床样本的队列，其中肺样本308份（主要为痰）、肺外样本99份（涵盖尿液、粪便、骨髓穿刺液、脑脊液等）；设立三种评估方案——方案1以涂片镜检与培养为独立参照，方案2采用复合参考标准（composite reference standard, CRS，任一检测阳性即判定为阳性），方案3以Seegene为参照并排除Ct≥35的结果以降低低菌量扩增干扰；所有样本同步完成齐尔-尼尔森（Ziehl–Neelsen）染色涂片镜检、罗氏（L?wenstein-Jensen）固体培养及三种qPCR检测，通过交叉反应实验验证试剂盒分析特异性，采用统计学方法计算符合率、灵敏度、特异度、阳性预测值（positive predictive value, PPV）与阴性预测值（negative predictive value, NPV）。
研究结果按方案分述如下。方案1中，以涂片镜检为参照时，Viasure与Seegene灵敏度极高（分别为0.927与0.829），但特异度偏低（分别为0.456与0.519），此差异源于涂片镜检对真阳性样本的漏检；以培养为参照时，Viasure与Seegene仍能检出多数培养阳性病例，但Sansure灵敏度仅为0.479，显著低于前两者。方案2中，基于CRS的评估显示，涂片与培养对CRS阳性病例的检出率分别仅为19.4%与46.2%，而Viasure与Seegene对MTBC的总灵敏度达0.733与0.710，覆盖队列中大部分分枝杆菌感染；Sansure对MTBC灵敏度仅为0.209，表现欠佳。针对NTM，Viasure总灵敏度为0.875、特异度为0.980，显著优于Sansure（灵敏度0.188、特异度0.979）与Seegene（灵敏度0.125、特异度0.997）。方案3中，限定Ct<35并以Seegene为参照时，Viasure与Sansure的MTBC检测符合率分别达0.918与0.938，Viasure灵敏度更高（0.971）但特异度略低（0.889），Sansure则几乎无假阳性但漏检更多；因过滤后Seegene NTM阳性数极少，该方案未获得可靠的NTM性能数据。
讨论与结论部分指出，三种试剂盒的性能分层明确：Viasure与Seegene为高产出分子检测工具，其中Viasure对NTM的检出优势尤为突出；Sansure虽特异度高，但灵敏度不足，仅略优于传统涂片镜检，难以弥补传统方法的局限。研究局限性包括：涂片镜检采用齐尔-尼尔森法而非灵敏度更高的荧光染色，培养仅用罗氏固体培养基而未纳入液体培养系统，可能影响对传统方法性能的评估；样本类型分布不均，肺外样本中组织活检占比低，且未进行培养阳性株的种水平确认，限制了NTM物种特异性分析。尽管如此，研究结果反映了厄瓜多尔真实世界的实验室实践，为中高负担地区优化分枝杆菌诊断路径提供了依据：推荐将高灵敏度qPCR（尤其是Viasure与Seegene）作为核心初筛工具，快速区分MTBC与NTM，同时保留培养用于药物敏感性试验与物种鉴定，以提升诊断效率并改善患者预后。
