《Microbiology Spectrum》：Pilot evaluation of a compact targeted next-generation sequencing with minimum biocontainment for rapid diagnosis of drug-resistant tuberculosis
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下一代测序相较于表型药物敏感性试验（pDST）是一种更快速、稳健的耐药结核病（DR-TB）诊断技术。靶向下一代测序（tNGS）采用牛津纳米孔技术（ONT），可实现便捷、桌面式及便携化的全面耐药谱分析。研究人员纳入2022年1月至2023年6月期间351例细菌学
下一代测序相较于表型药物敏感性试验（pDST）是一种更快速、稳健的耐药结核病（DR-TB）诊断技术。靶向下一代测序（tNGS）采用牛津纳米孔技术（ONT），可实现便捷、桌面式及便携化的全面耐药谱分析。研究人员纳入2022年1月至2023年6月期间351例细菌学确诊结核病患者的痰标本或结核分枝杆菌（M. tb）分离株，评估了从常规快速即时检测所用核酸提取设备中直接获取DNA的可行性，该方法仅需最低生物安全防护。研究采用商业化Deeplex Myc-TB引物组对M. tb进行tNGS扩增，使用ONT快速条形码建库试剂盒完成文库制备，并在MinION Mk1C平台上进行测序。结果显示，采用Trueprep设备提取的DNA成功完成252份样本的tNGS测序，均获得谱系分型与耐药预测结果。测序深度分析显示，inhA基因平均深度最高（1160.11），rrl基因最低（89.52）。tNGS对利福平（RIF）、异烟肼（INH）、氟喹诺酮类（FQ）、氨基糖苷类（AMG）及利奈唑胺（LZD）的灵敏度分别为95%、88%、100%、100%和100%，特异度均为100%。tNGS与pDST的一致性分析显示，RIF、FQ、AMG、链霉素（STR）和LZD的Cohen’s kappa值介于0.90至1.00，吡嗪酰胺（PZA）和乙硫异烟胺（ETH）一致性低于0.8。本研究首次验证了在无需生物安全三级（BSL3）实验室条件下，采用便携式ONT设备结合Trueprep AUTO核酸提取系统，可直接对未处理痰标本进行tNGS耐药检测。研究人员还自主开发了配套生物信息学分析流程，并在ICMR-NIRT完成验证，已开源发布于GitHub平台。基于上述结果，研究团队提出了适用于中低收入国家的耐药结核病tNGS检测路径，可在常规结核病防控体系中作为单一分子随访检测，配合本土化分析工具，实现快速耐药结核病的公平可及。
该研究针对全球结核病高负担地区耐药结核病（DR-TB）诊断周期长、生物安全要求高、检测覆盖药物不全等核心问题展开。2023年全球估算1080万新发结核病患者中，仅79%完成利福平耐药检测，广泛耐药及准广泛耐药结核病占比达5.5%，凸显快速全面耐药谱分析的紧迫性。现有低中等复杂度核酸检测技术虽可快速检测一线及部分二线药耐药，但无法覆盖吡嗪酰胺（PZA）、乙胺丁醇（EMB）、贝达喹啉（BDQ）、利奈唑胺（LZD）等关键药物；表型药物敏感性试验（pDST）作为耐药判定金标准，周转时间长达5–6周，严重延误精准治疗。全基因组测序（WGS）成本高、实验与生物信息分析门槛高，难以在低资源地区推广。靶向下一代测序（tNGS）聚焦耐药相关基因，结合便携式牛津纳米孔技术（ONT）设备，为破解上述困境提供了可能，但尚未验证其在最低生物安全防护下的直接痰标本检测可行性。为此，印度医学研究理事会国家结核病研究所（ICMR-NIRT）团队开展前瞻性评估，旨在验证自动化核酸提取系统与便携式tNGS平台在基层实验室的适用性，并开发适配的生物信息学工具，最终提出可纳入国家结核病规划的检测路径。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：纳入泰米尔纳德邦DR-TB中心351例细菌学确诊肺结核患者队列，涵盖痰标本、处理后痰沉渣及液体/固体培养物；使用Trueprep AUTO自动化核酸提取设备从不同类型标本中直接提取DNA，并与常规提取方法进行比较；采用商业化Deeplex Myc-TB引物组进行耐药靶区扩增，结合ONT快速条形码建库试剂盒构建测序文库，在MinION Mk1C平台上完成tNGS测序；自主开发基于Minimap2与Bcftools的shell脚本生物信息学流程，使用印度突变目录V2.0进行耐药注释，并与一线/二线线性探针 assay（LPA）、全基因组测序（WGS）及pDST结果进行一致性分析。
研究结果部分，首先在样本分布与DNA提取方法比较中，研究人员发现痰标本经Trueprep AUTO提取的平均DNA浓度（311.82 μg/mL）与Genolyse法处理的痰沉渣（291.77 μg/mL）相当，而固体培养物经cTAB法提取的产量（743.61 μg/mL）显著高于液体培养的Trueprep提取（86.67 μg/mL），所有样本均在PCR前标准化至等量模板。在不同DNA类型的tNGS运行成功率比较中，Trueprep法直接提取痰标本的成功率为60.58%，高于Genolyse法的47.7%；培养物中cTAB法提取成功率（93.8%）优于Trueprep法（72.0%）。菌负荷与tNGS运行成功率的关联分析显示，涂片抗酸杆菌阳性（主要为2+）样本中，不同菌负荷梯度的成功率无显著差异，总体痰标本成功率为58.58%。定制生物信息学流程验证部分，研究人员开发的流程支持ONT原始数据碱基识别、拆分、比对及变异过滤，以≥90%等位基因支持度判定固定耐药变异，15%–90%判定异质性耐药，与WGS谱系一致性达97.5%，已开源发布。tNGS谱系与单核苷酸多态性（SNP）分析中，inhA基因平均测序深度最高（1160.11），rrl基因最低（89.52）；耐药相关突变以katG S315T（INH，79.21%）、rpoB S450L（RIF，66.33%）最为常见；谱系1占成功运行样本的57.36%，符合南印度流行特征。耐药谱分布显示，252份成功样本中INH耐药率最高（39%），其次为RIF与氟喹诺酮类（各28%），未发现BDQ与CFZ耐药。tNGS与LPA、WGS及pDST的比较结果显示，对RIF、INH、氟喹诺酮类、AMG及LZD的灵敏度分别达95%、88%、100%、100%及100%，Cohen’s kappa值在0.85–1.00区间，一致性优异；仅PZA与ETH一致性略低，与WGS表现一致。
讨论部分指出，本研究首次证实Trueprep AUTO提取可在非BSL3条件下直接用于痰标本tNGS检测，无需传统痰标本前处理所需的生物安全柜与复杂通风设施，适配基层实验室条件。该设备已在印度全国部署3615台，剩余DNA可直接用于后续分子检测，避免重复采样与提取。局限性在于未覆盖涂片阴性、低菌负荷样本，且商用Deeplex Myc-TB引物未包含BDQ与CFZ耐药相关基因Rv1979c，导致两例LZD耐药合并BDQ/CFZ耐药未能检出。研究提出的分层检测路径建议：高菌负荷样本直接采用Trueprep DNA进行tNGS，低菌负荷样本结合MGIT培养，整体周转时间较pDST缩短2–3周。成本效益模型显示，在印度采用tNGS替代LPA联合pDST可降低年度检测支出。研究人员强调，该方案需多中心验证以确认其在不同层级实验室的操作可行性，并建议扩充引物覆盖新药耐药基因，进一步提升全面耐药谱分析能力。
结论部分明确，该前瞻性评估验证了便携式ONT平台结合Trueprep AUTO核酸提取系统在最低生物安全防护下开展tNGS的可行性，可显著缩短耐药结核病诊断周期，支持短程BPaLM/BPaL方案的精准实施。配套开源生物信息学流程降低了数据分析门槛，提出的检测路径有助于在中低收入国家实现快速、全面的耐药结核病检测公平可及，减少耐药菌株传播。
