Pel胞外多糖调控铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）与脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）的种间相互作用

《mSystems》：The Pel polysaccharide modulates interspecies interactions between Pseudomonas aeruginosa and Mycobacterium abscessus

　　

调节剂疗法改善了囊性纤维化（CF）患者（pwCF）的预后，目前超过50%的pwCF年龄超过18岁。这导致非典型病原体的流行率增加，包括非结核分枝杆菌（NTM）。NTM和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的CF分离率很高，那些共定殖的患者临床结局更差。因此，研究人员调查了这两种生物体在双物种生物被膜中的行为。研究人员发现，脓肿分枝杆菌（MAB）的共培养促进了铜绿假单胞菌的生物被膜形成。共聚焦成像显示，与MAB共培养期间，铜绿假单胞菌生物被膜的生物量和结构组织发生变化。DNase处理略微减少了双物种生物被膜，但在铜绿假单胞菌的Pel缺陷突变体中，生物被膜形成被消除。此外，MAB刺激了铜绿假单胞菌与MAB双物种生物被膜中Pel多糖的过量产生。 furthermore，双物种培养促进了铜绿假单胞菌对妥布霉素处理的耐受性。最后，转录组学分析显示，MAB改变了影响铜绿假单胞菌生物被膜形成的基因的表达。总体而言，研究人员的发现强调了铜绿假单胞菌和脓肿分枝杆菌之间一种依赖Pel的相互作用，这可能导致pwCF在抗生素治疗期间的细菌持续存在。

论文解读：Pel胞外多糖调控铜绿假单胞菌与脓肿分枝杆菌的种间相互作用

研究背景及意义

囊性纤维化（Cystic Fibrosis, CF）是一种由囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）基因突变引起的遗传性疾病，其肺部表现以过度炎症、黏液阻塞、黏液清除减少以及先天免疫功能失调为特征。这些因素导致慢性肺部细菌感染无法解决。尽管CFTR调节剂疗法改善了肺功能和生活质量，但未能完全根除pwCF中的细菌感染。此外，pwCF年龄增长以及长期使用抗生素治疗导致非传统且抗生素耐药的CF病原体出现，包括非结核分枝杆菌（Non-tuberculous mycobacteria, NTM）。在pwCF中，脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus, MAB）和鸟分枝杆菌复合群（Mycobacterium avium complex, MAC）是最常见的NTM物种，其中MAB定殖与肺功能比MAC或其他传统CF病原体更严重的下降相关。增厚的黏液和黏液纤毛清除的减少使CF肺易于以慢性、复杂的多微生物生物被膜形式定殖病原体，其中主要病原体是铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, Pa）。Pa存在于超过一半的pwCF中，并已知在共感染期间与许多CF病原体相互作用以改变感染动态。NTM的获得与Pa的存在没有很好的相关性，尽管它们可以以相对较高的比率共同分离。重要的是，共感染NTM和Pa的非CF支气管扩张患者文献记载的肺功能下降速率比单独感染任一种的患者更陡，表明这两种生物在毒力方面的协同作用。先前实验和流行病学研究表明，Pa和NTM之间的相互作用有助于感染的严重性。因此，研究人员决定研究这两种生物在双物种生物被膜中共培养期间的行为。该研究论文发表于《mSystems》。

主要关键技术方法

研究人员建立了体外静态双物种生物被膜模型，使用标准非黏液型实验室菌株PAO1和黏液型临床分离株mPA08-31（铜绿假单胞菌），以及脓肿分枝杆菌（MAB）的光滑（S）和粗糙（R）形态型。主要技术方法包括：结晶紫（Crystal Violet）染色法测定生物被膜生物量；差异平板计数法测定活菌菌落形成单位（CFU）；共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy）结合BiofilmQ软件进行生物被膜三维结构（体积、高度、距基底距离）定量成像；DNase处理和Congo Red染色分别评估胞外DNA（eDNA）和Pel多糖在生物被膜基质中的作用；妥布霉素（Tobramycin）药敏处理评估生物被膜抗生素耐受性；以及RNA测序（RNA-seq）和转录组学分析（包括DESeq2差异表达分析和clusterProfiler基因集富集分析）以探讨MAB存在下铜绿假单胞菌的基因表达变化。

研究结果

共培养铜绿假单胞菌和MAB促进生物被膜形成

研究人员首先在不同时间间隔将铜绿假单胞菌（PAO1或mPA08-31）与MAB（S或R形态型）进行单物种和双物种生物被膜培养。通过结晶紫测定测量生物被膜生物量并标准化为总生长量。结果显示，24小时后，当PAO1与MAB的任一形态型共培养时，生物被膜生物量显著增加；而对于mPA08-31，生物量增加出现在48小时（与S和R形态型）和72小时（仅与R形态型）。差异平板计数显示，除72小时mPA08-31与R形态型共培养外，铜绿假单胞菌的CFU无显著增加；而共培养期间活MAB迅速减少，48小时下降约3-log，72小时PAO1共培养中低于检测限。热灭活MAB未能诱导铜绿假单胞菌生物被膜增加。共聚焦成像显示，双物种生物被膜在24小时明显厚于单物种生物被膜，MAB主要定位于生物被膜底部，铜绿假单胞菌位于顶部，且这种分层具有形态型依赖性。

胞外DNA有助于增加的生物被膜形成

鉴于双物种生物被膜中总生物量增加但活CFU未增加，研究人员假设死MAB释放的胞外DNA（eDNA）负责生物量增加的表型。DNase处理实验表明，DNase处理略微减少了双物种生物被膜生物量，并在24小时消除了PAO1的表型增强，且在双物种生物被膜中DNase引起的生物量变化大于单物种。共聚焦成像和定量证实，DNase处理减少了双物种生物被膜的密度和体积/高度增强，尤其在PAO1中。这表明eDNA是双物种生物被膜基质的重要组成部分，特别是在早期时间点。

Pel多糖是增加生物被膜生物量所必需的，且在双物种生物被膜中过量产生

由于Pel多糖已知与eDNA交联，且eDNA在双物种生物被膜中起作用，研究人员假设Pel也参与生物被膜促进。使用PAO1的pelA转poson插入突变株（PW6140），结晶紫测定显示该突变体在24小时失去了MAB诱导的生物量增加表型，且双物种中Pel缺失的影响大于单物种。Congo Red染色显示，MAB刺激了双物种培养中Pel的过量产生（早在6小时开始），而pelA突变体无Pel染色。PA14（产Pel但不产Psl或藻酸盐）共培养时生物量也增加，FRD1（过量产藻酸盐，较少Pel/Psl）仅轻微增加。这表明Pel在早期与MAB共培养的生物被膜增强中具有特别重要的作用。

MAB促进铜绿假单胞菌对妥布霉素的耐受性

由于Pel多糖已知有助于包括妥布霉素在内的抗菌素耐药性，研究人员测试了单物种与双物种生物被膜中铜绿假单胞菌对妥布霉素的敏感性。24小时生物被膜用妥布霉素（50 μg/mL）处理1小时后，单物种培养中活铜绿假单胞菌减少，而存在MAB时减少较少，即双物种生物被膜中铜绿假单胞菌的存活率显著高于单物种（PAO1与MAB(S)，mPA08-31与两种形态型）。共聚焦成像显示，妥布霉素处理后，双物种生物被膜的铜绿假单胞菌体积显著大于单物种。这表明与MAB共培养除了增厚生物被膜基质和过量产生Pel外，还降低了铜绿假单胞菌对常用抗假单胞菌药物妥布霉素的易感性。

MAB的存在调节铜绿假单胞菌代谢和生物被膜相关基因的表达

研究人员对LB和合成CF培养基（SCFM2）中生长的铜绿假单胞菌生物被膜（单物种或与MAB共培养）进行了RNA测序。主成分分析显示MAB存在引起适度基因表达差异。差异表达分析显示，LB中57个基因差异调节（50个下调），SCFM2中16个差异表达。最常上调的共享基因是PA0752（tctA），编码三羧酸盐转运系统TctABC的跨膜亚基。LB中下调基因包括脂肪族酰胺酶操纵子（amiEBCRS）等已知影响生物被膜形成的基因；SCFM2中可见鞭毛组装相关基因（flgF, flgD）上调，Psl和LPS生物合途径下调。基因集富集分析显示LB中丙酮酸代谢、核糖体、乙醛酸旁路和三羧酸（TCA）循环途径显著上调，反硝化途径下调；SCFM2中仅鞭毛组装途径显著上调。这表明MAB的存在导致铜绿假单胞菌中枢代谢过程转变，可能通过摄取MAB分泌代谢物或死亡后营养物质以增加生物被膜形成。

讨论与结论总结

研究人员通过建立双物种生物被膜模型，测量生物被膜生物量、结构和抗菌处理耐受性，表明尽管共培养期间MAB被迅速杀死，铜绿假单胞菌的生物被膜生物量在各种菌株中均增加，且与MAB形态型无关。这种生物量增加并非源于细菌细胞数量相应增加，而是生物被膜基质成分的作用。DNase降解实验表明eDNA可能参与，而主要非黏液型铜绿假单胞菌胞外多糖Pel的缺失消除了24小时MAB存在时的生物量增加，且双培养中Pel过量产生，表明Pel可能在早期生物被膜发育中与MAB互作时对铜绿假单胞菌的促进至关重要。DNase结果与Pel缺失相呼应，提示eDNA和Pel共同作用于早期双物种生物被膜生物量增加。共培养也增加了铜绿假单胞菌对妥布霉素的耐受性。转录组学分析发现，MAB存在下铜绿假单胞菌差异表达涉及中枢代谢及已知影响生物被膜形成的基因（在LB和人工CF痰液培养基中）。这些结果表明，铜绿假单胞菌与MAB的双物种相互作用可能导致肺部感染期间的持续存在，以及即使在适当抗生素治疗下感染难以清除。研究人员也指出该研究受限于富培养基体外生物被膜模型，虽部分转录组变化在富培养基与合成CF痰液培养基间共享，但需在更接近CF疾病的条件下（如细胞培养模型）进一步研究确认临床相关性。总之，该研究证明两种相关晚期CF病原体（铜绿假单胞菌与MAB）共培养有助于疾病相关表型，包括生物被膜形成增加和抗菌耐受性；并证明eDNA和Pel这两个已知有助于感染顽固性的生物被膜基质成分参与了双物种感染期间的生物被膜形成增加。未来需要进一步研究MAB对铜绿假单胞菌中枢代谢和生物被膜发育分子决定的影响，以识别可被用于复杂感染治疗的脆弱途径。