牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technologies）提供的RNA测序数据，用于研究B群脑膜炎奈瑟菌（Neisseria meningitidis）中相位可变DNA甲基转移酶ModD1对表观遗传调控的影响

《Microbiology Resource Announcements》：Oxford Nanopore Technologies RNA sequencing data for investigating epigenetic regulation by phase-variable DNA methyltransferase ModD1 in serogroup B Neisseria meningitidis

　　

摘要

脑膜炎奈瑟菌是细菌性脑膜炎和败血症的主要致病菌，这对全球公共卫生构成了重大威胁。本文报告了使用牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technologies）对 脑膜炎奈瑟菌 B血清型M0579株进行的RNA测序结果。该菌株编码了一种相位可变的DNA甲基转移酶ModD1，这种酶是一种与高侵袭性脑膜炎奈瑟菌谱系相关的表观遗传调节因子。

公告

脑膜炎奈瑟菌 B血清型是细菌性脑膜炎和败血症的主要原因（1）。这种病原体编码相位可变的N⁶-腺嘌呤DNA甲基转移酶（Mods），这些酶通过高度可变的简单序列重复区（SSR）发生开启-关闭（相位变异）切换（2–4）。当Mods被表达时，它们会在整个基因组中建立甲基化模式，从而重塑转录过程，导致基因表达的协同变化（相位变异）（3, 5, 6, 7）。不同的Mods具有不同的靶识别结构域，这些结构域决定了它们的甲基化模式和独特的相位变异（3, 6）。高侵袭性脑膜炎奈瑟菌B株M0579（克隆复合体cc41/44）编码ModD1（3），其相位变异由其5′-ACCGA-3′ SSR区域的突变驱动，并通过5′-CCAGC-3′基序的甲基化来调节基因表达（6）。在此，我们宣布发布了牛津纳米孔技术（ONT）对M0579的RNA-seq资源，包括野生型ModD1开启状态和同基因型modD1::kan敲除（KO）菌株的测序结果（3），数据为生物学重复三次（表1）。全长ONT长读长序列能够解析转录本边界和操纵子结构，并支持ModD1开启状态和KO状态基因型之间的操纵子水平表达比较。

表1

表1每个样本的ONT测序摘要表^a,b

访问号SRR36929598SAMN54471611SRR36929599SAMN54471612SRR36929600SAMN54471613^cSRR36929601SAMN54471614^cSRR36929602SAMN54471615^cSRR36929603SAMN54471616

菌株	基因型	重复次数	读长（n）	产量（bp）	N50（bp）	生物样本访问号
M0579	modD1 开启	1	1,301,624	617,396,901	512
M0579	modD1 开启	2	580,816	332,431,691	581
M0579	modD1 开启	3	348,303	192,935,306	581
M0579	modD1::kan	1	33,691	17,588,279	608
M0579	modD1::kan	2	5,974,908	3,149,941,066	545
M0579	modD1::kan	3	16,266	6,010,975	359

^a

重复次数（biological）；n表示读长数量；SRA表示序列读取档案。

^b

脑膜炎奈瑟菌 M0579的基因组大小为2.27 Mb，GC含量为51.53%，共有2,266个注释基因。M0579是一种临床菌株，于1993年从美国的一名患有侵袭性脑膜炎的患者身上分离得到。

^c

不同重复样本间的读长差异可能会影响差异表达分析的效果；然而，这份ONT长读长数据集补充了之前单独发布的Illumina高深度RNA-seq数据集（8），这两组数据将在即将发表的全面研究中进行整合。

菌株在20毫升淋球菌培养基（9）中培养，其中添加了30 μM的去铁胺（Sigma-Aldrich），以模拟与宿主相关的铁限制条件，这种条件之前已用于脑膜炎奈瑟菌的转录组学研究（2）。培养条件为37°C，伴有气泡搅拌（200 rpm）。按照制造商的说明，使用Tritizol（ThermoFisher）从4毫升对数中期（OD₆₀₀ = 0.3）阶段的细胞中提取总RNA。通过紫外吸光度检测RNA的浓度和纯度，并通过琼脂糖凝胶电泳评估其完整性。在RNA提取之前，通过荧光PCR扩增和modD1 SSR区域的片段长度分析验证了培养细胞的ModD1开启状态（约90%开启）（3）。在去除核糖体RNA（NEBNext rRNA-Depletion Kit, Bacteria; NEB）和Polyadenylation（大肠杆菌 Poly(A)-Polymerase; NEB）后，通过PCR（14个循环）合成全长双链cDNA，用于ONT-seq文库制备（cDNA-PCR Barcoding Kit-24-V14; SQK-PCB114.24）。文库在ONT MinION（R10.4.1流式细胞）上进行测序，原始信号使用Dorado v7.6.8（super-accurate model v4.3.0）进行碱基 calling。在碱基 calling过程中进行了接头修剪和质量过滤（Dorado; --trim all和Q10），生成FASTQ文件。使用Flye（v2.9.2; --nano-hq预设；基因组大小估计为2.3 Mbp）进行了从头转录组组装。对于基于参考序列的分析，将读长与M0579基因组（RefSeq访问号：GCF_001029835.1）对齐，使用minimap2（v2.26; -x-map-ont参数）。对齐文件使用SAMtools（v1.21）进行处理。

转录组重建和定量使用StringTie2（v2.2.1）进行。根据参考注释，为每个基因型生成初始组装结果。合并特定基因型的转录组（stringtie; --merge），生成基因和转录本水平的丰度矩阵（prepDE.py3；中位读长通过seqkit v2.11.0确定，10），并独立从对齐文件中确定基因计数（featureCounts；Subread suite v2.0.4），目标属性为gene_id。该流程针对ON和KO状态的单独和合并FASTQ文件进行，以便进行样本和基因型级别的比较。

总体而言，这些ONT长读长RNA-seq数据提供了一种可解析操纵子的转录组资源，超越了单纯的差异基因表达分析，支持对转录结构和mRNA异构体的基因型比较。这有助于更深入地研究ModD1驱动的基因调控机制以及促进脑膜炎奈瑟菌转录程序的表观遗传切换的分子机制，相关结果将在后续的手稿中报道。

致谢

本研究由澳大利亚研究委员会（Australian Research Council）发现项目DP230101499资助，该项目授予M.P.J.和K.L.S。K.L.S.和M.P.J.还分别获得了澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC）的调查员资助GNT2017383和GNT2026356。L.M.J.和C.J.W.也获得了NHMRC的资助GNT1194325。