《PLOS Genetics》：Cas9-expressing HC-04 hepatocytes facilitate CRISPR-based analysis of Plasmodium falciparum sporozoite-host interactions
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恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）是全球致死率最高的疟疾寄生虫，其感染性子孢子由受染按蚊在吸血时注入人体皮肤，必须迁移至肝脏才能启动感染。子孢子在肝内入侵肝细胞并发育为红前期裂殖体，最终进入血液并感染红细胞引发临床症状。子孢子在宿主体内的
恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）是全球致死率最高的疟疾寄生虫，其感染性子孢子由受染按蚊在吸血时注入人体皮肤，必须迁移至肝脏才能启动感染。子孢子在肝内入侵肝细胞并发育为红前期裂殖体，最终进入血液并感染红细胞引发临床症状。子孢子在宿主体内的迁移依赖细胞穿行（cell traversal）机制，即短暂进出宿主细胞，通过裂解膜结构深入组织并逃避免疫清除。到达肝脏后，子孢子会穿行多个肝细胞，最终选择一个肝细胞进行功能性入侵并建立红前期形式（exoerythrocytic form）。目前，关于穿行、入侵及胞内发育的分子机制，尤其是宿主因子的作用仍不完全清楚。为解决这一问题，研究人员对人源HC?04肝细胞系进行了工程改造，使其稳定表达Cas9?mCherry融合蛋白，从而实现基于CRISPR的功能基因组学研究。经检测，HC?04.2B3克隆具有活跃的Cas9核酸内切酶活性，可通过非同源末端连接（NHEJ）实现向导RNA（sgRNA）介导的基因敲除。研究人员优化了细胞穿行与入侵实验条件，建立了可用于高通量筛选人基因在恶性疟原虫感染中作用的流式检测方法。通过对10个已知参与细菌和病毒感染的人基因进行敲除验证，证明了该平台的应用潜力。虽然在本研究中未发现新的疟疾宿主因子，但该体系为解析肝细胞生物学及嗜肝病原体与宿主细胞的互作提供了可扩展的实验基础，并为全基因组CRISPR筛选揭示肝期感染的宿主决定因素奠定了基础。
研究背景与意义
恶性疟原虫是导致全球绝大多数疟疾死亡病例的病原体，其感染起始于子孢子在皮肤接种后的迁移与肝期发育。肝期感染处于临床无症状阶段，却是阻断传播的关键靶点。由于体外培养支持恶性疟原虫子孢子完成肝期发育的细胞系仅有HC?04肝细胞，且传统研究方法难以高效解析宿主因子在该过程中的作用，限制了针对早期感染的药物和疫苗开发。为此，研究人员构建了稳定表达Cas9的HC?04细胞系，结合优化的表型检测平台，为系统性研究宿主因子在子孢子穿行、入侵及早期发育中的作用提供了工具。该研究发表于《PLOS Genetics》，为肝期疟疾及嗜肝病原体研究建立了可扩展的功能基因组学平台。
关键技术方法
研究采用工程化慢病毒载体将Cas9?mCherry导入HC?04细胞，通过流式分选获得单克隆细胞系；利用流式细胞术结合荧光标记葡聚糖摄取实验评估子孢子穿行效率，并利用抗恶性疟原虫环子孢子蛋白（PfCSP）抗体染色检测入侵情况；通过诱导型sgRNA靶向BIM基因验证Cas9活性；对候选宿主基因进行阵列式CRISPR敲除，并结合下一代测序（NGS）确认基因型；在优化后的穿行与入侵同步检测体系中评估各基因敲除对感染的影响。
研究结果
Cas9+HC?04肝细胞克隆的生成与核酸内切酶活性验证
研究人员通过慢病毒转导与流式分选获得三个Cas9?mCherry阳性克隆，其中HC?04.2B3在子孢子穿行实验中未显示显著功能受损。诱导型sgRNA靶向BIM基因后，免疫印迹结果显示BIM蛋白水平下降超过75%，证实Cas9介导的高效基因敲除。
恶性疟原虫子孢子穿行实验的优化
在96孔板中以105细胞/孔的密度铺板可获得最高穿行率；子孢子解剖使用Schneider昆虫培养基并在IMDM中重悬，可显著提升穿行效率；提高感染复数（MOI）至4时，穿行率趋于平台，最高达92.5%。
穿行与入侵检测的同步优化
穿行与入侵实验可在同一批细胞中分别在第4小时和第24小时检测，IMDM作为入侵培养基与Advanced培养基效果无显著差异；MOI 0.5可平衡穿行与入侵检测灵敏度；第24小时的PfCSP阳性细胞比例更能反映功能性入侵事件。
HC?04.2B3作为宿主?病原体互作研究平台的验证
研究人员选取15个候选宿主基因进行CRISPR敲除，成功获得10个基因的克隆。在同步检测体系中，这些基因敲除均未显著影响子孢子穿行或入侵效率，提示它们并非短期检测窗口内的关键宿主因子，但验证了平台的稳定性与可扩展性。
讨论与结论翻译
恶性疟原虫子孢子与宿主肝细胞的分子互作对人类感染建立至关重要，但目前理解尚不完整。本研究构建了具备功能性Cas9活性的HC?04.2B3细胞系，保留了正常的子孢子穿行与入侵敏感性，并优化了实验条件以提高检测一致性和灵敏度。分离解剖与检测培养基显著提高了子孢子存活率，从而提高了穿行效率；使用汇合单层细胞更接近生理环境；MOI的选择需在穿行饱和与入侵检测灵敏度之间取得平衡；第24小时作为入侵检测终点可有效排除非功能性滞留的干扰。同步检测穿行与入侵减少了样本消耗，并揭示了两者之间的负相关关系，可能反映了子孢子行为转变或宿主免疫响应。尽管本次候选基因筛选未发现显著影响，但该平台为今后开展全基因组CRISPR筛选、解析宿主因子网络及评估干预策略提供了可靠基础。未来工作可将该体系扩展至更长周期的肝期发育检测，并结合多基因敲除与阳性对照通路验证，以全面揭示恶性疟原虫在肝脏阶段的宿主依赖机制。
