《Frontiers in Immunology》：Respiratory chain gene mutations associated with global phylogenetic clustering of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis revealed by whole-genome sequencing
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**摘要：** 结核分枝杆菌（*Mycobacterium tuberculosis*）呼吸链的调控机制尚待阐明，关于呼吸链基因突变对多重耐药（MDR）菌株影响的研究证据有限。本研究旨在阐明呼吸链基因突变对MDR菌株的影响。研究人员对结核分枝杆菌分析菌株进行了
**摘要：** 结核分枝杆菌（*Mycobacterium tuberculosis*）呼吸链的调控机制尚待阐明，关于呼吸链基因突变对多重耐药（MDR）菌株影响的研究证据有限。本研究旨在阐明呼吸链基因突变对MDR菌株的影响。研究人员对结核分枝杆菌分析菌株进行了全基因组测序（Whole-genome sequencing, WGS），并采用随机森林（Random forest）、梯度提升决策树（Gradient boosting decision tree）和广义线性混合模型（Generalized linear mixed models, GLMMs）识别促进MDR菌株系统发育聚集及形成的呼吸链基因突变。研究共纳入13,402株结核分枝杆菌，其中4,051株（30.09%）表现为MDR，1,044株（7.76%）为单药耐药（Single-drug resistance, SDR）。结果显示，atpH A428G、cydA C942A、qcrA G181C、nuoF G66C、qcrB G1250T、nuoA G82C以及nuoG A1422G A1810G的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms, SNPs）与MDR菌株的系统发育聚集显著相关；ndhA G1000A、atpH C73G A428G、cydA C942A、qcrA G181C、qcrB G55A、nuoG A1422G、nuoJ G115A、nuoN G1084T、cydB T126C、nuoA G82C、nuoB G490C、nuoF C171T及nuoK C73T的SNPs与MDR菌株的形成显著相关。本研究表明，呼吸链基因SNPs与MDR菌株的系统发育聚集及发生发展相关，为预防MDR菌株的系统发育聚集及发生发展提供了新见解，并为MDR菌株潜在治疗靶点的开发提供了有价值的信息。
结核病（Tuberculosis, TB）是由结核分枝杆菌（*Mycobacterium tuberculosis*）引起的传染病，对全球公共卫生构成重大挑战，尤其是随着多重耐药结核病（Multidrug-resistant TB, MDR-TB）的出现。据世界卫生组织（World Health Organization, WHO）估计，2021年全球约有450,000例新发利福平耐药结核病（Rifampicin-resistant TB, RR-TB），其中78%为MDR-TB。结核分枝杆菌的呼吸链基因编码多种蛋白质，这些蛋白质通过维持能量供应、氧化还原平衡和细胞呼吸功能，使细菌能够适应不同环境条件并维持生长繁殖，主要包括NADH脱氢酶（NADH dehydrogenase）、细胞色素氧化酶（Cytochrome oxidase）和ATP合酶（ATP synthase）等。尽管美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）已批准两种电子传递链抑制剂——ATP酶抑制剂贝达喹啉（Bedaquiline）和一氧化氮供体及呼吸毒物普托马尼（Pretomanid）用于多重耐药结核分枝杆菌的治疗，但关于呼吸链基因突变在MDR-TB传播中作用的研究仍十分有限。因此，深入理解MDR-TB的传播机制及其与呼吸链基因突变的关联至关重要。
本研究发表于《Frontiers in Immunology》，研究人员利用全基因组测序技术，基于基因组簇集代表结核分枝杆菌的传播，系统研究了呼吸链基因突变对全球MDR菌株传播的影响。研究旨在揭示呼吸链基因突变与MDR结核分枝杆菌系统发育聚集及发生发展之间的关联，为MDR-TB的防控及新型治疗靶点的开发提供理论依据。
研究人员开展此项研究主要采用了以下关键技术方法：全基因组测序技术，使用Illumina HiSeq 4000测序平台；生物信息学分析流程，包括BWA-MEM序列比对、FreeBayes变异检测及Bcftools、SAMtools等工具处理；单核苷酸多态性分析，运用SnpEff功能注释及Python自定义脚本；耐药预测采用TBProfiler及结核数据库（Tuberculosis database, TBDB）；系统发育分析采用最大似然法，使用IQ-TREE构建系统发育树，Jukes-Cantor核苷酸替换模型及gamma速率异质性模型；传播分析基于<12个SNPs定义簇集；统计建模采用广义线性混合模型（GLMMs，lme4包），以谱系和采样地点为随机截距，随机森林和梯度提升决策树（scikit-learn）进行特征重要性分析，Benjamini-Hochberg错误发现率（False discovery rate, FDR）校正多重检验。样本来源包括：2011-2018年中国山东省公共卫生临床研究中心和潍坊市呼吸病医院收集的1,550例结核分枝杆菌感染患者，排除标准包括既往治疗史、严重合并症及缺乏随访数据者，最终1,445株经测序后与11,957株公开全球菌株合并，共计13,402株符合分析标准（覆盖率≥98%，深度≥20×）。
**研究结果**
**3.1 样本描述：** 研究纳入全球13,402株结核分枝杆菌，多数属于lineage 4（6,382株，47.41%），其次为lineage 2（5,123株，38.06%）。菌株主要来自东亚（3,160株，23.48%）、东非（1,657株，12.31%）和北美（1,637株，12.16%）。其中MDR菌株4,051株（30.09%），SDR菌株1,044株（7.76%）；在MDR菌株中，成簇1,987株（49.05%），非成簇2,064株（50.95%）。
**3.2 MDR菌株传播与呼吸链基因突变：** 与非成簇MDR菌株相比，研究人员分析了62个SNPs与MDR成簇菌株的关系。GLMM显示10个SNPs与成簇显著相关（p<0.05），其中6个非同义SNPs和2个同义SNPs与成簇正相关，包括atpH A428G（OR=106.485）、cydA C942A（OR=6.11）、qcrA G181C（OR=21.585）、nuoF G66C（OR=4.938）、qcrB G1250T（OR=7.272）、nuoA G82C（OR=1.906）以及nuoG A1422G（OR=1.801）和A1810G（OR=4.229）。随机森林和梯度提升决策树模型显示，atpH A428G、cydA C942A、qcrB G1250T、nuoA G82C、qcrA G181C、nuoF G66C和nuoG A1422G贡献度最高，表明这些SNPs增加了MDR菌株的系统发育聚集风险。
**3.3 SDR与MDR菌株及呼吸链基因突变：** 与SDR菌株相比，分析77个SNPs与MDR形成的关联。GLMM显示16个SNPs与MDR形成显著相关（p<0.05），其中7个非同义SNPs和2个同义SNPs与MDR形成正相关，包括ndhA G1000A、atpH C73G和A428G、cydA C942A、qcrA G181C、qcrB G55A、nuoG A1422G、nuoJ G115A和nuoN G1084T。随机森林和梯度提升决策树模型证实，ndhA G1000A、atpH C73G A428G、cydA C942A、qcrA G181C、qcrB G55A、nuoG A1422G、nuoJ G115A和nuoN G1084T贡献度最高，表明这些变异与MDR形成相关。
**3.4 敏感菌株、MDR菌株与呼吸链基因突变：** 与敏感菌株相比，分析153个SNPs与MDR形成的关联。GLMM显示23个SNPs与MDR形成显著相关（p<0.05），其中8个非同义SNPs和3个同义SNPs与MDR形成正相关，包括ndhA G1000A、atpA G271C、cydA C942A和G1088A、cydB T126C、nuoA G82C、nuoB G490C、nuoF C171T、nuoG A1422G、nuoK C73T和nuoN G1084T。两种机器学习模型证实上述多数变异贡献度最高，但atpA G271C未在梯度提升决策树模型中显示贡献。这些结果表明这些SNPs增加了MDR菌株的发生风险。
**讨论：** 研究人员指出，MDR菌株中多数属于lineage 2（2,498株，61.7%；北京谱系），其次为lineage 4（1,386株，34.2%；欧洲谱系），MDR成簇菌株也主要属于lineage 2（1,617株，59.6%），表明全球MDR系统发育聚集的主要菌株为lineage 2。
研究人员特别强调，cydA C942A（同义SNP）和nuoG A1422G（非同义SNP）不仅与MDR传播聚集风险相关，也与MDR形成相关。cydA编码细胞色素bd泛醇氧化酶I亚基（Cytochrome bd ubiquinol oxidase subunit I），该酶不易受氧化应激抑制，能在不利条件下维持有氧代谢。早期研究表明cydA在结核分枝杆菌生长代谢中起关键作用，其缺失或突变可影响细胞色素bd酶的组装和活性，导致细菌利用氧气的能力下降。尽管cydA突变与某些实验性化合物的敏感性改变有关，但其与常规抗结核药物耐药性的关系尚不明确。本研究发现cydA C942A突变与MDR菌株传播显著相关，提示其可能存在独立于常规药物耐药的适应性优势。
此外，研究检测到qcrA和qcrB的非同义SNPs，这两个基因编码细胞色素bc1复合物（Complex III）的亚基。细胞色素bc1复合物是质子 motive 呼吸链的关键组分，也是候选药物Q203的靶点。qcrA/B突变此前与该类抑制剂耐药相关，尽管在本研究中检测频率较低，但提示了MDR流行菌株中呼吸适应策略的潜在多样性。
nuoG编码I型NAD(P)H脱氢酶（NDH-1）的一个亚基，该酶对抑制宿主巨噬细胞NOX2复合物产生的活性氧物质及抑制TNF介导的凋亡诱导至关重要。研究发现nuoG A1422G可能损害NDH-1的活性、表达或组装，导致结核分枝杆菌呼吸链和能量代谢紊乱，但其对细菌适应性和药物敏感性的生理影响有待进一步研究。nuoG A1810G也与结核分枝杆菌传播风险相关，可能改变NDH-1的功能或稳定性，进而影响细菌呼吸链和能量代谢。
值得注意的是，atpH基因的非同义SNP A428G与MDR菌株显著相关。atpH编码ATP合酶F0（ATP synthase F0）的关键亚基，该结构是细菌能量产生的核心组分。关于atpH的研究较为有限，推测该SNP变异可能破坏ATP合酶F0的结构完整性、功能效能或稳定性，导致代谢紊乱。另外，ndhA G1000A和nuoN G1084T这两个非同义SNPs与MDR发生风险显著相关，这两个基因均编码NADH脱氢酶的关键亚基，协同调控NADH的电子传递过程，对细菌能量产生和细胞代谢至关重要。
研究人员承认，目前对结核分枝杆菌呼吸链基因的理解仍处于初步阶段，所鉴定SNPs对蛋白质稳定性和活性的功能影响，以及在MDR传播和发生中的确切作用尚需进一步验证。关键下一步是将本研究菌株与全球数据库进行比较，以评估结果的普适性。
**研究结论：** 本研究发现，呼吸链基因突变可能增加MDR-TB系统发育聚集和发生的风险。这一认识为MDR-TB的预防提供了新视角，并强调了将呼吸链作为治疗靶点的潜力。
