比较转录组学分析揭示小菊头蝠独特的抗病毒免疫特征

《Frontiers in Immunology》：Comparative transcriptome analysis unveils unique antiviral immune signatures of Rhinolophus pusillus

背景：小菊头蝠（Rhinolophus pusillus）是目前已知唯一同时携带严重急性呼吸综合征相关冠状病毒（SARSr-CoVs）、严重急性呼吸综合征冠状病毒2相关冠状病毒（SC2r-CoVs）及兼具两者基因组特征的嵌合型萨贝冠状病毒重组谱系的自然宿主，但其多病毒共存与病毒耐受的分子基础尚未完全阐明。研究人员聚焦于该物种的基础基因表达模式，系统解析其免疫景观。方法：研究采集6只小菊头蝠与大菊头蝠（Rhinolophus ferrumequinum）的多组织样本并进行转录组测序，同时整合已发表的人畜共患疾病相关多种哺乳动物的公共RNA-seq数据集，开展跨物种比较转录组分析以评估基础免疫活性；采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）鉴定组织特异性调控模块，通过差异表达分析表征免疫相关转录差异，并构建长链非编码RNA（lncRNA）-信使RNA（mRNA）调控网络探索协同免疫调控机制。结果：小菊头蝠与其他哺乳动物相比，先天抗病毒免疫过程的基线转录活性显著升高，先天免疫反应与抗病毒防御相关基因显著富集，而炎症调控相关转录程序相对减弱。WGCNA识别出具有协同调控架构的组织特异性功能模块，显示小菊头蝠相较于大菊头蝠具备更强的病毒感染耐受转录特征。lncRNA分析表明，炎症响应与DNA损伤修复通过lncRNA-mRNA调控网络实现协同调控。结论：本研究通过整合蛋白质编码RNA的全面转录组分析与lncRNA预测，为多病毒共存条件下小菊头蝠病毒耐受机制的理解提供了基于组成型基因表达的系统分子框架，推进了对蝙蝠免疫生物学的认知，也为理解这一关键病毒储库物种的感染相关免疫适应提供了新见解。

研究背景方面，蝙蝠作为唯一具备动力飞行能力的哺乳动物，占现存哺乳动物物种约20%，不仅是超过100种病毒的自然储库，且通常能在无明显症状的情况下长期携带病毒，这种独特的病毒耐受能力被认为与其免疫系统在抗病毒反应与炎症控制之间的平衡调控密切相关。在公共卫生层面，21世纪以来严重急性呼吸综合征（SARS）与新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的暴发，凸显了萨贝冠状病毒属（Betacoronavirus亚属）的持续威胁，而菊头蝠科是其主要的自然储库。值得注意的是，小菊头蝠是目前已知唯一同时携带SARSr-CoVs、SC2r-CoVs及嵌合型重组毒株谱系的物种，其病毒多样性显著高于同属其他近缘物种，这种独特的多病毒共存模式为解析长期病毒持续存在的分子机制提供了不可替代的研究模型。然而，当前针对小菊头蝠的基础生物学研究仍十分有限，缺乏系统的基因组资源与多组织转录组数据集，极大限制了对其进化动态、生态适应、宿主-病毒互作及免疫调控机制的深入探究，因此亟需开展整合组学层面的研究，系统解析其支持多病毒共存的分子基础。该研究由研究人员完成并发表于《Frontiers in Immunology》。

关键技术方法方面，研究人员于2020至2023年间从中国云南、广西、北京、浙江四省野外捕获3只成年雄性小菊头蝠与3只成年雄性大菊头蝠，采集心脏、肝脏、肠道、脾脏、肾脏、肺、脑、肌肉8种组织样本，经物种形态学与线粒体细胞色素b（cytb）基因分子鉴定后提取总RNA。研究构建了48个转录组测序文库并进行Illumina高通量测序，同时整合来自公共数据库的7种人畜共患相关哺乳动物及人类的健康脾脏转录组数据。通过同源基因鉴定、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、差异表达分析及长链非编码RNA（lncRNA）预测与靶基因推断，系统开展跨物种比较转录组学分析。

研究结果部分，首先为测序数据集与功能注释概述。研究共产生约45亿条原始双端测序读段，平均每个样本9400万条读段，经质量控制后获得558 GB高质量数据用于后续分析。小菊头蝠与小菊头蝠参考基因组的平均比对率分别为82.6%与85.83%，其中唯一比对率分别为76.87%与82.87%。功能注释结果显示，小菊头蝠共有19045个基因在NR数据库中获得注释，15902个与15902个基因分别在Pfam与Swiss-Prot数据库中完成注释，并通过 reciprocal best hit（RBH）策略鉴定出人与蝙蝠的直系同源基因，用于跨物种比较分析。所有个体均未检测到活动性病毒感染的转录证据，符合野外健康观察结果。

其次为跨物种比较转录组分析。整合新生成数据与公共数据集构建包含10种哺乳动物的脾脏表达矩阵后，研究人员选取每种物种表达量最高的1000个基因进行基因本体（GO）富集分析。结果显示，小菊头蝠在先天免疫反应（GO:0045087）、免疫应答正向调控（GO:0050778）、先天免疫应答调控（GO:0045088）及免疫应答激活（GO:0002253）等多个免疫相关类别中富集程度最高。与人和小鼠等其他物种相比，小菊头蝠的先天免疫调控与抗病毒免疫应答相关基因转录活性显著升高，而炎症应答调控相关基因转录活性相对减弱。差异表达分析进一步证实，小菊头蝠脾脏中90%的干扰素刺激基因（ISGs）、补体系统组分及I型干扰素信号通路核心分子均呈上调表达，显示出持续升高的基线抗病毒基因表达特征。

第三为小菊头蝠组织的加权基因共表达网络分析（WGCNA）。基于24个小菊头蝠多组织样本的转录图谱，研究将表达模式相似的基因聚类为17个功能模块，并识别出组织特异性模块。功能富集分析显示，肠道模块显著富集于组织形态发生、上皮细胞分化及微绒毛组装等过程，反映其屏障维持与稳态功能；脾脏模块则显著富集于免疫系统过程的正负调控、白细胞迁移增殖、免疫效应过程及肿瘤坏死因子超家族与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联等细胞因子响应通路，凸显其中枢免疫调控作用。除脾脏外，肝脏、肾脏、肌肉等组织模块也不同程度富集免疫相关过程，提示小菊头蝠的免疫调控是由多组织协同贡献的整合网络。

第四为小菊头蝠与大菊头蝠的差异表达分析。跨8种组织的比较显示，两种菊头蝠在代谢与免疫相关过程上存在显著差异。肝脏、肠道、肺与心脏中差异表达基因主要富集于小分子代谢、有机酸代谢等代谢调控通路；而肾脏、肝脏与肺则共同富集于先天与适应性免疫应答通路。脾脏的差异表达基因同时涵盖先天免疫、体液免疫及免疫细胞招募黏附等多层次免疫过程，其中GPBAR1、MSS51等基因的上调与核糖体蛋白及RNA加工因子的下调，可能共同支撑其免疫与生理稳态的特异性适应。

第五为小菊头蝠先天免疫枢纽基因的鉴定。针对脾脏差异表达基因的富集分析显示，小菊头蝠上调基因主要富集于免疫应答相关过程，而大菊头蝠上调基因则以代谢过程为主。研究人员聚焦先天免疫相关通路，通过蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析，结合多算法筛选鉴定出16个核心免疫枢纽基因。这些基因涵盖病毒识别受体DDX58（RIG-I）、TRIM25，cGAS-STING信号轴关键适配分子STING1，以及下游抗病毒效应分子MX2、OAS3、IFIT2等，共同构成多层次细胞内抗病毒防御系统。

第六为小菊头蝠免疫特征的长链非编码RNA（lncRNA）调控。研究共预测出1249个直系同源lncRNA，其中562个被鉴定为免疫相关lncRNA（irlncRNAs）。共表达网络分析显示，多个hub lncRNA与免疫相关基因呈现组织特异性共表达模式。通过顺式与反式靶基因预测及功能富集分析发现，顺式调控靶基因主要富集于核苷酸切除修复与DNA损伤检查点调控，提示其在基因组稳定性维持中的作用；反式调控靶基因则显著富集于炎症应答、防御反应及细胞外基质组织等过程，表明其可能参与精细调控免疫激活并维持组织完整性，共同支撑小菊头蝠的低炎症与病毒耐受状态。

讨论与结论部分，研究人员指出该研究通过多组织跨物种比较转录组学整合分析，系统揭示了小菊头蝠“高基线先天抗病毒应答-低炎症激活-多组织协同调控”的免疫转录架构。这种协调的调控模式可能是其作为多种萨贝冠状病毒自然储库却能维持长期病毒耐受的核心机制，反映了蝙蝠在与病毒长期共进化过程中形成的独特免疫适应策略。研究发现的RIG-I、STING1等枢纽基因及lncRNA介导的协同调控网络，为理解病毒储库的免疫耐受机制提供了新的分子靶点。尽管受限于野外样本获取难度导致样本量较小，且未涵盖感染动态过程，但该研究填补了小菊头蝠系统转录组资源的空白，为后续深入解析宿主-病毒互作及人畜共患病溢出风险提供了重要的基础数据与理论框架。研究最终结论强调，小菊头蝠通过组成型高表达的先天抗病毒免疫程序与受控的炎症反应，实现了多病毒共存下的免疫稳态，这种系统水平的免疫调控特征是其作为关键病毒储库的重要分子基础。