全转录组分析外周血揭示自然感染副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, MAP）的亚临床荷斯坦奶牛系统性先天免疫反应及翻译抑制

《Frontiers in Immunology》：Whole transcriptome analysis of peripheral blood identifies systemic innate immune responses and translation inhibition in subclinical Holstein cattle naturally infected with Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis

　　

牛副结核病（Paratuberculosis, PTB）由副结核分枝杆菌（MAP）引起，是一种慢性肉芽肿性肠道疾病，在全球乳制品行业造成显著经济损失。现有诊断方法灵敏度有限，仅能可靠检出处于晚期病变阶段并伴有明显临床症状的动物，而无法识别早期或亚临床阶段、肠道组织呈局灶或多局灶病变的感染个体。既往研究表明多局灶性肉芽肿可阻止病变进展，但MAP慢性感染建立和维持的分子机制尚不完全清楚。本研究旨在比较外周血中多局灶病变荷斯坦奶牛与无肠道病变奶牛的全转录组谱。研究人员从11头无PTB临床症状的多局灶病变奶牛和4头经多种PTB诊断检测均为阴性的无病变对照奶牛的外周血中提取总RNA，采用Illumina NEBNext Ultra Directional RNA建库试剂盒制备RNA文库，并在Illumina NextSeq测序仪上进行测序。外周血样本平均获得3408万条原始读段（raw reads）。与对照组相比，多局灶病变奶牛外周血中鉴定出1272个差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）。蛋白互作分析显示多个DEGs高度互联，并与剪接、翻译抑制相关分子过程以及外周血中强烈的先天免疫反应激活有关。总体而言，本研究为MAP致病机制提供了新见解，并鉴定出潜在的生物标志物和治疗靶点。

本研究发表于《Frontiers in Immunology》，针对牛副结核病（PTB）早期诊断困难的问题展开。PTB由副结核分枝杆菌（MAP）引起，全球超过50%的牛群受感染，每年造成约40亿美元经济损失，且与克罗恩病等多种人类炎症及自身免疫疾病存在潜在关联。当前MAP抗体ELISA和粪便PCR等方法灵敏度不足，难以检测细菌载量低、免疫反应微弱的亚临床感染，亟需发现新的生物标志物。已有研究显示，多局灶性肉芽肿可能与慢性感染维持有关，但其分子机制尚未明确。研究人员通过对自然感染MAP并具有多局灶肠道病变的亚临床荷斯坦奶牛外周血进行全转录组测序，结合生物信息学分析，首次揭示了该阶段宿主系统性先天免疫激活与全局翻译抑制并存的分子特征，为理解MAP慢性感染机制及开发新型诊断工具提供了重要依据。

关键技术方法包括：样本来源于西班牙同一商业牧场的15头荷斯坦奶牛，其中11头经组织病理学确诊为多局灶肠道病变，4头为无病变且多项检测阴性的对照；采用PAXgene采血管收集外周血并提取总RNA，构建Illumina RNA测序文库并进行单端测序；利用STAR比对至牛参考基因组（ARS_UCD2.0），通过DESeq2进行差异表达分析；借助ClusterProfiler进行基因本体（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析；利用STRING与Cytoscape构建蛋白-蛋白互作（PPI）网络；并通过RT-qPCR与ELISA对候选基因ISG15的表达进行验证。

研究结果如下：

外周血转录组谱分析：多局灶病变组与对照组相比共鉴定出1272个DEGs，其中442个上调，830个下调。上调基因包括细胞色素P450家族4亚家族F成员22（CYP4F22）、腺苷酸环化酶8（ADCY8）、潜在转化生长因子β结合蛋白4（LTBP4）、T-box转录因子3（TBX3）及2'-5'-寡腺苷酸合成酶1（OAS1Y）等，提示存在抗炎调控与抗病毒样免疫反应。

功能富集分析：DEGs显著富集于翻译（GO:0006412）、RNA剪接（GO:0008380）、mRNA加工（GO:0006397）等生物学过程，以及核糖体（GO:0022626）、核糖核蛋白复合物（GO:1990904）和剪接体复合物（GO:0005681）等细胞组分，表明这些基础生物过程在多局灶病变奶牛外周血中被广泛抑制。

通路富集分析：KEGG分析显示核糖体通路（bta03010）显著富集且包含35个一致下调的核糖体蛋白基因，提示全局翻译活性降低；同时富集于COVID-19（bta05171）、产热（bta04714）及帕金森病（bta05012）通路，反映线粒体功能、免疫调节等多方面的协同变化。

蛋白互作网络分析：PPI网络识别出由17个下调核糖体蛋白构成的中心枢纽，并与参与剪接体snRNP组装的小核核糖核蛋白多肽F（SNRPF）存在功能互作，证实翻译与剪接过程均受抑制。网络中ISG15、ZBP1、DHX58及OAS1Y等先天免疫相关基因形成协同调控模块，其中ISG15通过ISGylation修饰可能介导翻译抑制。

ISG15表达验证：RT-qPCR验证了ISG15 mRNA在多局灶病变组显著上调（P=0.03），与RNA-Seq结果高度相关（ρ=0.98, P=1.667E-11）；但血浆ELISA检测显示ISG15蛋白水平虽略有升高却未达统计学显著性（P=0.6881），提示存在转录后调控或蛋白降解影响。

讨论部分指出，本研究首次在亚临床MAP感染中观察到系统性翻译抑制现象，这与ISG15介导的免疫调控及病原体持续存在策略相关。OAS1Y、ISG15、ZBP1和DHX58构成的先天免疫防御网络能有效识别胞内菌并限制其复制，同时通过调控翻译和剪接过程平衡免疫反应与组织损伤。COVID-19与帕金森病通路的富集反映了跨疾病的共同应激与防御机制，特别是线粒体呼吸与自噬抑制的潜在联系。研究结论强调，MAP慢性感染依赖于宿主先天免疫激活与调控、翻译重编程及代谢适应的精细平衡，这些发现为阐明MAP致病机理及挖掘亚临床感染生物标志物提供了新视角。