《Frontiers in Genome Editing》：A high-throughput, streamlined cloning protocol to generate guide RNAs for CRISPR activation
编辑推荐：
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans, C. elegans）是研究基因功能与疾病发病机制的强大模式生物。虽然RNA干扰（RNA interference, RNAi）能有效抑制基因表达，但CRISPR激活（CRISPR activati
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans, C. elegans）是研究基因功能与疾病发病机制的强大模式生物。虽然RNA干扰（RNA interference, RNAi）能有效抑制基因表达，但CRISPR激活（CRISPR activation, CRISPRa）为上调C. elegans内源性基因表达提供了可靠工具。与基于显微注射的传统方法相比，基于喂食的CRISPRa与RNAi类似，具有简便、经济、高效的特点。然而，传统克隆流程仍是高通量基因筛选的瓶颈。研究人员在此展示了一种 pooled（混合）、一步法双gRNA克隆方案，可实现CRISPRa用gRNA表达载体的快速高效构建。在测试案例中，通过设计含有一个gRNA的55-mer和54-mer引物，研究人员在单一反应流程中扩增并混合了126个gRNA插入片段。这126个gRNA克隆通过三轮混合克隆完成，每轮覆盖率达42%–56%，剩余克隆单独处理。该方案显著减少时间、劳动力和试剂消耗，同时提高可扩展性并保持可重复性。其特别适用于基因文库或通路的高通量筛选，并支持表型筛选和寿命分析等下游应用。该研究通过提供大规模基因激活研究的实用工具，推进了基于CRISPRa的C. elegans功能基因组学发展。
研究背景与问题
秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans, C. elegans）长期作为研究基因功能、代谢通路以及发育、神经生物学和衰老遗传基础的模式生物，RNA干扰（RNA interference, RNAi）通过系统性的基因敲降在功能基因组学中发挥了核心作用。在C. elegans中，RNAi可通过喂食表达靶向兴趣基因双链RNA的细菌来实现，且可通过将线虫转移进出RNAi细菌实现基因沉默的时间特异性控制，还可利用组织特异性RNAi品系实现组织特异性敲降。然而，RNAi仅限于基因沉默，无法用于检验基因激活或功能获得效应。例如，参与能量代谢和内质网未折叠蛋白反应（endoplasmic reticulum unfolded protein response, ER-UPR）的基因随年龄增长而下调，其表达降低与衰老及神经退行性疾病相关。上调或过表达这些基因可为衰老机制、神经退行性疾病发病机制及其保护或修复功能提供见解。目前，在C. elegans中增加基因表达通常需要通过显微注射或微粒轰击产生转基因品系，这些方法劳动密集、耗时、效率低，且可能因随机整合造成非预期遗传扰动。
CRISPR激活（CRISPR activation, CRISPRa）是一种实用的基因上调替代方案，该技术利用修饰的CRISPR-Cas9系统增强特定基因表达而不改变底层DNA序列。CRISPRa使用失活的Cas9蛋白（deactivated Cas9, dCas9），其结合特定DNA序列但不切割DNA。为增强基因激活，dCas9与转录激活结构域如VP64、p65或p300融合，招募细胞转录机器。dCas9-激活因子复合物由向导RNA（guide RNA, gRNA）引导至靶基因启动子区域以促进转录。该方法允许精确、可逆的基因活性控制，广泛应用于疾病建模、药物发现和功能基因组学。在C. elegans中，Fischer等人已证实可通过细菌喂食递送启动子特异性gRNA实现基因激活，该方法使用L4440_BioBrick-sgRNA载体在HT115大肠杆菌（Escherichia coli, E. coli）中表达一对gRNA，喂食表达密码子优化dCas9::VP64融合蛋白的C. elegans品系以激活内源基因。虽然这种喂食系统简化了gRNA递送，对单个基因研究有效，但用于大规模或全基因组筛选的gRNA克隆过程因其耗时多步、劳动密集的特性仍是瓶颈。
为应对这一局限，研究人员开发了简化的、一步法CRISPR-Cas9双gRNA克隆方案，结合混合策略生成用于C. elegans高通量CRISPRa筛选的gRNA表达载体。通过设计含gRNA共有序列的两条引物，使用相同载体作为模板扩增克隆插入片段，将克隆方法从两步改为一步，并将克隆插入片段混合为单一样本，该策略可同时生成靶向数百甚至数千基因的gRNA构建体。
主要技术方法
该研究利用实验室自行制备的HT115感受态细胞，采用pooled（混合）策略进行克隆。核心技术包括：设计55-mer和54-mer引物，以L4440_BioBrick-EV载体为模板，使用Platinum? SuperFi? II DNA聚合酶进行PCR扩增；将多个gRNA插入片段等量混合后，用BsaI-HF限制性内切酶消化产生黏性末端；载体L4440_BioBrick-sgRNA经BbsI和BsaI双酶切并去磷酸化；采用Instant Sticky-end Ligase Master Mix进行连接反应，转化HT115感受态细胞；通过三引物菌落PCR筛选阳性克隆，并进行Sanger测序验证；使用qPCR检测靶基因mRNA水平，通过寿命分析实验验证gRNA功能。
研究结果
克隆引物设计与gRNA选择
研究人员从靶基因启动子区域选择gRNA靶序列，确保不含BsaI酶切位点。gRNA选自Fischer等人构建的文库，通过IDT在线工具"CRISPR-Cas9 gRNA checker"验证，要求on-target和off-target评分均高于50。对于文库未覆盖的基因，通过查阅已发表数据定位转录起始位点（transcription start site, TSS），于TSS上游-50至-400 bp区域设计gRNA。由于使用双gRNA表达载体，每个基因至少选择两个gRNA，并设计四个靶向不同分散位点的gRNA以优化基因表达效率。正向引物和反向引物分别设计为55-mer和54-mer，含BsaI酶切位点，用于扩增包含第一个gRNA骨架序列和第二个T7启动子之间的克隆插入片段。
克隆插入片段制备
使用设计引物和L4440_Biobrick EV载体模板PCR扩增克隆插入片段。PCR反应体系为20 μL，程序包括98°C初始变性30秒，28个循环（98°C 10秒、60°C 10秒、72°C 5秒），最终延伸72°C 2分钟。2 μL PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，应显示约191 bp的强单一条带。取等量（1–3 μL）PCR产物混合于单一管中，使用PCR纯化柱纯化。研究人员指出，由于引物长度、结合序列、PCR条件和产物长度均相同，不同反应的PCR效率和产量一致，因此可混合数百或数千个PCR产物。这些PCR产物仅需扩增一次用于混合克隆策略，剩余产物可保存于-20°C用于多轮克隆。
酶切与纯化
纯化后的PCR产物用BsaI-HF消化，37°C孵育1小时，80°C灭活20分钟。1 μg纯化PCR产物的消化足以用于后续连接，产生167 bp带黏性末端的片段。酶切产物经PCR纯化柱纯化后，使用NanoDrop微量分光光度计测定DNA浓度。载体L4440_BioBrick-sgRNA经BbsI和BsaI双酶切，并去磷酸化处理以防止自连。酶切产生2729 bp、119 bp和两个24 bp片段，通过琼脂糖凝胶电泳和胶回收纯化2729 bp载体片段。研究人员指出，该步骤仅需执行一次，纯化载体可用于多轮克隆。
连接、转化与菌落筛选
消化纯化的PCR产物与载体按4:1摩尔比连接，每管连接反应使用50–100 ng载体。连接产物转化HT115感受态细胞，于含羧苄青霉素和四环素的LB平板培养。由于HT115感受态细胞转化效率低于DH5α，需尝试不同量细胞以获得适量菌落。通过三引物菌落PCR筛选阳性克隆：正向引物F、内部反向引物R1和外部反向引物R2。阳性菌落显示419 bp单一条带，阴性菌落显示277 bp和419 bp两条带。研究人员指出，若使用混合方法克隆大量gRNA，由于阳性率极高（>98%），可跳过此筛选步骤，直接使用测序引物进行菌落PCR并送测序。
验证与应用
研究人员将构建的克隆用于激活hsf-1及其下游靶基因hsp16.1，qPCR检测显示hsf-1 mRNA水平呈增加趋势，hsp16.1 mRNA水平显著增加。此外，研究人员还利用部分克隆进行 longevity（长寿）基因筛选，发现激活pink-1（编码线粒体蛋白，参与线粒体自噬和应激抵抗）显著延长C. elegans寿命，激活gst-21、F11E6.4、pgp-15和gst-4也显著增加寿命。
讨论与结论
研究人员开发的高通量混合克隆方案显著提升了传统gRNA克隆方法的效率。这种效率源于引物和PCR产物的均一设计，确保了所有克隆的扩增、消化、连接和转化效率一致。混合策略最小化了单个反应数量，允许在单管中同时克隆数百甚至数千个构建体，减少时间和试剂消耗。
在实施方案中，126个gRNA克隆通过三轮混合克隆实现，平均菌落阳性率达98%，每轮克隆覆盖率为42%–56%。该流程中，PCR扩增、载体消化、去磷酸化和凝胶提取仅需执行一次，首轮克隆从PCR扩增到转化约需2天，后续轮次的纯化、消化、连接和转化可在1天内完成，次日进行菌落PCR筛选和测序，整个流程1周内可获得测序结果。
该方案的可扩展性使其特别适用于大规模功能基因组学研究，如筛选基因文库或整个通路。使用E. coli HT115进行gRNA递送进一步简化了工作流程，利用了C. elegans研究中已建立的RNAi喂食基础设施。高菌落阳性率（>95%）消除了大量菌落PCR筛选的需要。当规模超过1000个构建体时，建议增加混合克隆轮数，每轮仅筛选30%–50%的理论克隆数，以提高筛选效率，将总筛选菌落数控制在1.5n以内。
该方案也可用于哺乳动物细胞基于CRISPR的基因激活和抑制（CRISPR interference, CRISPRi）筛选，仅需轻微修饰表达载体。该研究通过提供大规模基因激活研究的实用工具，推进了基于CRISPRa的C. elegans功能基因组学发展，为基因调控、疾病机制和潜在治疗干预的发现铺平了道路。
