《Clinical Epigenetics》：NSD1 governs H3K36me2-mediated DNA methylation and drives endo-mesodermal differentiation of human iPSCs
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表观遗传调控机制，包括组蛋白修饰与DNA甲基化（DNA methylation, DNAm），在发育与衰老过程中发挥核心作用。H3K36二甲基化（H3K36me2）主要由组蛋白甲基转移酶NSD1沉积，且主要分布于基因间区，并可募集DNA甲基转移酶DNMT3A，
表观遗传调控机制，包括组蛋白修饰与DNA甲基化（DNA methylation, DNAm），在发育与衰老过程中发挥核心作用。H3K36二甲基化（H3K36me2）主要由组蛋白甲基转移酶NSD1沉积，且主要分布于基因间区，并可募集DNA甲基转移酶DNMT3A，从而促进DNA甲基化。体内NSD1单倍剂量不足可导致过度生长性疾病Sotos综合征，该疾病与异常DNA甲基化特征以及表观遗传年龄增加相关。为理解NSD1调控发育、分化及疾病的机制，研究人员构建了功能性NSD1缺失的人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）系（NSD1-KO）。NSD1-KO细胞表现出底物特异性的增殖下降、H3K36me2水平降低以及广泛的DNA低甲基化。值得注意的是，功能性NSD1的缺失改变了iPSCs的分化潜能，导致内胚层与中胚层谱系承诺异常。进一步分析显示，NSD1可能通过调控内胚层长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）“HIDEN”的表达来驱动内胚层分化，而该机制独立于DNA甲基化调控。所建立的NSD1-KO iPSC系部分重现了与NSD1相关发育障碍有关的DNA甲基化缺陷。此外，研究还揭示了NSD1调控人iPSCs内胚层分化的一种新机制。
该研究发表于《Clinical Epigenetics》，聚焦于NSD1这一关键组蛋白甲基转移酶在人体早期发育相关表观遗传调控中的作用。研究背景在于，H3K36me2与DNA甲基化之间存在重要串扰，前者可通过募集DNMT3A参与建立基因组甲基化图谱，而NSD1又是人类细胞中沉积H3K36me2的主要酶之一。既往研究已提示NSD1异常与Sotos综合征等发育性疾病密切相关，并伴随广泛DNA低甲基化及表观遗传年龄加速，但NSD1如何在人体多能干细胞中协调染色质修饰、DNA甲基化与谱系分化，仍缺乏系统阐明。因此，开展这项研究的必要性在于：一方面可解析NSD1介导的H3K36me2-DNAm调控轴如何塑造人类早期发育；另一方面可为NSD1相关发育障碍的分子病理机制提供人源模型与机制依据。
研究人员利用CRISPR/Cas9在人体诱导多能干细胞中靶向NSD1，构建了3个功能缺失克隆，系统评估其对H3K36me2、DNA甲基化、转录组及三胚层分化能力的影响。结果显示，NSD1功能缺失显著降低H3K36me2富集，尤其是在增强子与基因间区，并引起大范围DNA低甲基化，其分布格局与Sotos综合征患者样本及na?ve多能状态具有部分重叠。同时，NSD1缺失并未消除细胞多能性标志，却明显损害内胚层和中胚层分化潜能。进一步机制研究提示，NSD1可能通过维持内胚层lncRNA HIDEN的表达，进而影响WNT信号相关分化程序，该作用并不依赖HIDEN位点周围DNA甲基化变化。总体而言，研究表明NSD1不仅是维持H3K36me2介导DNA甲基化图谱的重要上游调控因子，也是驱动人iPSCs向内胚层-中胚层分化的重要决定因素。这一发现对于理解Sotos综合征等NSD1相关过度生长疾病的早期发育缺陷具有重要意义。
研究所用主要关键技术方法包括：基于骨髓来源间充质基质细胞重编程建立的人iPSC队列；采用CRISPR/Cas9对NSD1第3外显子进行基因编辑并通过Sanger测序鉴定克隆；通过Western blot、免疫荧光和染色质免疫沉淀测序（chromatin immunoprecipitation sequencing, ChIP-seq）评估H3K36me2变化；采用Illumina EPIC甲基化芯片分析全基因组DNA甲基化并结合表观遗传年龄时钟计算；采用RNA测序（RNA-seq）分析转录组；通过三胚层定向分化、qRT-PCR、免疫表型分析和PluripotencyScreen甲基化反卷积评估分化潜能，并以CHIR99021进行WNT激动剂救援实验。
Genetic modification of NSD1 induces loss of H3K36 dimethylation in human iPSCs
研究人员将CRISPR/Cas9靶向人NSD1基因第3外显子，成功获得3株NSD1功能缺失iPSC。Sanger测序证实存在移码或插入缺失变异。虽然未能直接在蛋白水平完整证明NSD1缺失，但Western blot、免疫表型分析及H3K36me2 ChIP-seq均显示H3K36me2显著下降，且在增强子区域下降尤为明显。不同克隆残余H3K36me2水平存在差异，提示可能仍受NSD2、NSD3等其他甲基转移酶部分补偿。尽管H3K36me2显著丢失，NSD1-KO细胞仍保留OCT4/POU5F1相关多能性特征与阳性的Epi-Pluri-Score，说明其未脱离多能状态。此外，NSD1-KO细胞在Vitronectin上生长受损，但在Biolaminin 521 LN上生长接近野生型，显示NSD1缺失伴随基质依赖性的增殖缺陷。
NSD1-KO induces global DNA hypomethylation, similar to Sotos syndrome and na?ve stem cells
为明确NSD1介导H3K36me2减少后的表观遗传后果，研究人员进行了全基因组DNA甲基化分析。结果显示，NSD1-KO与野生型在甲基化谱上清晰分离，且出现14,043个显著低甲基化CpG位点，而高甲基化位点仅607个。低甲基化位点主要定位于基因间区，这与H3K36me2主要分布区域相吻合。进一步与Sotos综合征公开数据比较发现，患者中显著低甲基化的CpG中有69.25%在NSD1-KO iPSCs中也呈低甲基化，提示该模型可部分重现Sotos综合征的甲基化异常。cg07600533这一Sotos综合征诊断性位点亦显著低甲基化。表观遗传年龄分析显示，NSD1-KO iPSCs相较野生型存在轻度但显著的年龄加速。与癌症相关NSD1失活样本比较未见重叠，但与na?ve干细胞比较则有51.1%的低甲基化CpG重合，提示NSD1缺失可能使细胞部分偏向“na?ve-like”表观遗传状态。RNA-seq显示，尽管甲基化改变广泛，转录变化总体较温和，仅有174个基因上调、75个基因下调，且DNA甲基化改变与转录变化并不简单线性对应，支持NSD1在DNA甲基化调控与转录调控中可能具有相对独立的功能。
NSD1-KO iPSCs exhibit endodermal and mesodermal differentiation defects
在明确NSD1-KO维持多能性后，研究人员进一步检测其三胚层分化潜能。qRT-PCR结果显示，内胚层标志基因GATA6在NSD1-KO细胞定向分化后显著下降，提示内胚层分化障碍；中胚层TBXT与外胚层PAX6在该检测条件下无显著差异。免疫荧光进一步证实，野生型在内胚层诱导后多数细胞为GATA6阳性，而NSD1-KO中GATA6几乎缺失。借助PluripotencyScreen甲基化评分体系，研究人员发现NSD1-KO在定向分化后仍保留较高比例的多能性甲基化特征，尤其在内胚层和中胚层方向分化受阻更为明显。值得注意的是，NSD1-KO细胞无法进一步分化为诱导间充质基质细胞（induced mesenchymal stromal cells, iMSCs），进一步支持其在中胚层/间充质谱系承诺中存在实质性障碍。对NSD1-KO内胚层细胞的甲基化与转录组分析显示，其仍存在广泛DNA低甲基化，且超过62%的低甲基化位点已在未分化iPSCs阶段出现，说明这类异常在分化前已预先建立。同时，内胚层关键基因FOXA1、FOXA2、GATA6、HHEX、KLF5以及若干中胚层相关基因如NOTCH1、BMP2、TWIST1均被下调，表明NSD1对于早期胚层命运决定具有关键作用。
The role of NSD1 in endodermal differentiation
针对更为显著的内胚层缺陷，研究人员进一步分析其机制。NSD1缺失后，内胚层细胞中的高甲基化CpG在启动子区域富集，并与转录调控、图式指定和器官形态发生相关基因集显著相关；与此同时，下调基因也富集于细胞分化、发育及细胞黏附等功能类别。这说明，部分内胚层缺陷可能源于分化相关基因启动子高甲基化及其转录抑制。结合ENCODE数据，研究人员发现GATA6和GATA4等关键内胚层调控因子是多梳复合体（polycomb）靶基因，提示NSD1介导的H3K36me2丢失可能促进这些位点发生H3K27me3沉积，从而加重多梳介导的沉默并抑制内胚层程序。
更重要的是，研究锁定了内胚层特异性lncRNA HIDEN。RNA-seq与qRT-PCR均表明，HIDEN在NSD1-KO未分化状态和内胚层分化状态中均显著下调。ChIP-seq提示，野生型iPSCs中HIDEN区域存在H3K36me2富集，而NSD1-KO中该富集明显减弱；但HIDEN启动子及基因体周边多个CpG位点并未出现显著DNA甲基化变化。这一结果说明，NSD1对HIDEN表达的调控并不依赖局部DNA甲基化改变，而更可能直接或间接依赖H3K36me2相关染色质环境。进一步将NSD1-KO内胚层与既往发表的HIDEN-KO内胚层转录组比较，发现两者在部分上调和下调基因上呈一致变化，支持HIDEN作为NSD1下游效应分子参与内胚层分化。最后，WNT激动剂CHIR99021可显著恢复NSD1-KO细胞内胚层标志基因GATA6、FOXA2和GATA4的表达，表明NSD1可能通过HIDEN-WNT轴促进内胚层形成。
讨论部分总结
讨论部分指出，该研究建立了功能性NSD1缺失的人iPSC模型，提供了研究NSD1相关发育障碍早期机制的人源系统。虽然由于NSD2、NSD3等酶的存在，H3K36me2未完全消失，但多种检测一致证明NSD1缺失足以造成显著表型。研究证实NSD1缺失与Sotos综合征一样导致严重DNA低甲基化，但转录改变相对有限，提示NSD1丢失所致甲基化异常可能在发育早期即已建立，而其转录后果则具有谱系和阶段特异性。NSD1-KO细胞在分化后仍保留较高多能性分子特征，并呈现部分类似na?ve干细胞的DNAm与表达倾向，这可能解释其内胚层和中胚层分化受阻。对内胚层而言，缺陷既可能与分化相关基因启动子高甲基化有关，也可能与H3K36me2缺失后多梳抑制增强有关。与此同时，HIDEN被鉴定为NSD1介导内胚层分化的关键候选lncRNA，提示NSD1兼具两类作用：一是维持细胞类型特异的DNA甲基化图谱，二是通过调控发育相关lncRNA和分化基因表达来控制命运决定。整体上，NSD1缺失引发的基因间区低甲基化、分化基因启动子甲基化重分布以及发育相关转录程序紊乱，可能共同导致研究中观察到的谱系特异性分化障碍，并为理解Sotos综合征等过度生长疾病提供了重要线索。
研究结论部分翻译
研究结果表明，NSD1介导的H3K36二甲基化（H3K36me2）是调控人iPSCs中DNA甲基化图谱与分化潜能的重要机制。功能性NSD1缺失导致广泛DNA低甲基化，部分重现了Sotos综合征相关的DNA甲基化缺陷，并损害内胚层和中胚层分化。进一步地，研究揭示NSD1可能通过一种独立于DNA甲基化调控的机制，调节内胚层lncRNA HIDEN的表达，从而促进内胚层分化。由此，NSD1不仅是维持表观基因组稳态的关键因子，也是在人体早期胚层命运决定中具有重要作用的发育调控因子。
