《VIEW》：Abunmix enables the simple and robust multiplexed immunofluorescence imaging
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在过去的十年中，空间蛋白质组学（spatial proteomics）不仅在神经科学和癌症研究中，而且在发育生物学、药物递送研究以及类器官研究中引起了广泛关注。为了满足这一不断增长的需求，各种多重免疫荧光成像技术应运而生。然而，尽管取得了这些进展，这些技术要在
在过去的十年中，空间蛋白质组学（spatial proteomics）不仅在神经科学和癌症研究中，而且在发育生物学、药物递送研究以及类器官研究中引起了广泛关注。为了满足这一不断增长的需求，各种多重免疫荧光成像技术应运而生。然而，尽管取得了这些进展，这些技术要在典型实验室中得到更广泛应用仍面临一项挑战：宿主物种有限的抗体制剂。在本研究中，展示了一种称为 Abunmix 的技术，该技术能够利用来自同一宿主物种的一抗进行间接染色。在 Abunmix 中，与不同荧光团偶联的一抗和二抗依次应用于样本。染色后，采集多通道图像。由于使用了来自同一宿主的一抗，生成的图像包含多种蛋白质的混合信号。随后，应用信号解混算法（signal-unmixing algorithms）将混合信号分离为每种蛋白质的独立信号。通过这种方法，利用常规的一抗和二抗即可实现基于多种同种属一抗间接染色的多重成像，无需任何特殊化学试剂或仪器。鉴于其极低的实验要求，Abunmix 将加速多重免疫荧光成像技术的普及，推动不同生物领域的研究与诊断发展。
空间蛋白质组学旨在研究高度异质系统（如肿瘤和大脑）中细胞及其微环境的三维组织结构，这一领域已引起极大兴趣。该方法依赖于蛋白质的显微成像，其中免疫荧光（immunofluorescence）是实现这一目标的常用方法。最广泛使用的免疫荧光方法是利用一抗染色抗原，随后使用荧光团偶联的二抗放大信号。然而，在设计多重蛋白质成像实验时，必须考虑多个因素以防止蛋白质间的信号串扰。首先，应避免使用发射光谱相似的荧光团；其次，应使用来自不同宿主物种的一抗。这两个因素需要同时仔细优化和考量，以实现高特异性和高准确性的多重成像。虽然前沿的光谱解混技术可以解决第一个问题，但针对第二个问题（即需要使用不同宿主物种的一抗）的技术受到的关注却少得多。
使用不同宿主物种一抗的需求给多重成像实验设计带来了重大挑战。通常，间接染色比直接染色能获得更高的信号强度，这使得其适用于低丰度蛋白质的成像。在间接染色中，使用来自同一物种的一抗会导致蛋白质间出现信号串扰（bleed-through signals），因此必须使用来自不同宿主物种的一抗。然而，大多数商业一抗来自不到 10 种有限的宿主物种，主要是兔或小鼠。随着光谱解混技术的进步，现在可以同时使用超过 4 种甚至多达 15 种荧光团，这使得宿主物种受限的问题日益突出。虽然使用能结合特定同型或亚类的二抗是一种潜在的解决方案，但经过验证的抗体仅限于少数动物物种，且市场上可用的同型或亚类在构建检测多种蛋白质的抗体组合方面存在局限性。另一种解决方案是使用与寡核苷酸偶联的一抗，随后通过 DNA 杂交进行原位信号放大。然而，DNA-抗体偶联过程可能很复杂，往往需要对每种抗体进行仔细的优化和验证。因此，迫切需要一种方法，能够在间接免疫染色中同时使用来自同一宿主物种的一抗，以促进蛋白质的多重成像，同时保持高检测限。
针对上述问题，研究人员开发了 Abunmix（Antibody signal unmixing，抗体信号解混），这是一种消除因使用同种属一抗而产生的串扰信号的解决方案。在 Abunmix 中，来自同一宿主物种的一抗和偶联了不同荧光团的二抗依次应用于样本。染色并采集图像后，通过信号解混算法消除由抗体交叉反应引起的串扰信号。在此过程中，研究人员采用了两种算法：一种是专为解混光谱重叠荧光团的荧光信号而开发的算法，另一种是基于自监督机器学习新开发的算法。研究证明，Abunmix 允许在小鼠脑切片的多重成像中使用多种兔源一抗。
研究人员开展该研究主要用到的关键技术方法包括：首先，采用顺序间接免疫荧光染色策略，依次应用针对同一宿主（如兔）的一抗和偶联不同荧光团的二抗 Fab 片段（Fab fragments），利用 Fab 片段仅有一个抗原结合位点的特性，最大限度减少第二类抗体交叉反应。其次，引入两种核心解混算法处理采集到的混合图像：一是基于互信息（Mutual Information, MI）最小化的盲解混算法，假设完美解混后的图像间互信息最低；二是新开发的基于自监督机器学习（Machine Learning, ML）的解混算法，该算法包含解混层、采样函数和独立性评估网络，通过对抗训练使输出通道间的信号相互独立，无需预先知道混合特征。此外，在多色成像实验中，结合了多轮染色后的多聚甲醛（PFA）固定步骤以防止抗体脱落重结合，并结合 MAX Eraser 抗体洗脱技术实现了多轮循环染色。实验样本主要来源于 4-12 周龄的雄性 C57BL/6J 小鼠脑切片。
研究结果部分首先阐述了 Abunmix 的一般工作原理。研究人员发现，当顺序使用两种同源一抗及其对应的 IgG 二抗时，会发生两类抗体交叉反应。通过使用二抗的 Fab 片段，有效抑制了第二类交叉反应。实验观察到，第一张图像（IMG1）仅包含第一种蛋白信号，而第二张图像（IMG2）则包含两种蛋白的混合信号。由于荧光团和成像条件的差异，直接相减无法完全去除串扰。研究人员利用 MI 基和 ML 基两种算法成功从 IMG2 中分离出纯净的第二种蛋白信号。模拟定量评估显示，两种算法的皮尔逊相关系数（PCC）均超过 0.99，表明其具有可靠的解混性能。
在 Abunmix 的验证部分，研究人员对小鼠脑切片进行了多种蛋白（如 CALB1、NeuN、PV 与 GFAP 的组合）的染色实验。结果显示，经过 MI 基或 ML 基算法处理后，成功去除了第一种蛋白的串扰信号，获得了清晰的 GFAP 信号图像，其纤维结构特征明显。通过结构水平的 PCC 分析，解混后的图像与直接染色获得的真值图像（Ground Truth）表现出高度一致性，平均 PCC 值在 0.79 至 0.91 之间，该性能与间接染色和直接染色之间的自然差异相当。对于高度重叠的结构，Abunmix 同样表现良好。虽然解混后的图像中存在少量由散粒噪声（shot noise）引起的残留信号，但经高斯平滑处理后，这些残留信号强度较低，不影响生物学解释。此外，研究人员测试了 20 种不同的抗体对，其中 16 种成功实现了预期解混，表明该方法具有广泛的适用性。
在多色成像应用中，研究人员进一步测试了 Abunmix 在四种及以上蛋白成像中的能力。通过顺序标记四种兔源一抗并配合 PFA 固定步骤，成功实现了四色成像。针对多轮染色中可能出现的残留信号问题，通过引入额外的解混步骤（利用早期图像作为参考）得到了有效解决。结合抗体洗脱策略，研究人员甚至实现了三轮循环染色，展示了获取超过四种通道图像的潜力。最后，通过将 Abunmix 应用于海马区细胞分类和计数，定量分析结果与文献报道一致，证实了该技术在生物研究中的实用性。
讨论部分总结指出，Abunmix 成功解决了同种属抗体间接染色中的信号串扰问题，实现了仅用兔源一抗对小鼠脑进行四重成像。研究强调，Abunmix 的图像具有独特性，如 IMG1 的信号总是包含在 IMG2 中，且两种图像采集自不同的光谱通道，可能引入色差等问题。模拟表明，空间重叠本身不是影响解混质量的主要因素，关键在于最小化图像间的混合程度。光漂白可能导致解混误差，建议采取相应措施减轻影响。虽然本研究主要使用 Fab 片段，但对于满足线性假设的部分一抗，标准 IgG 也可用于三色成像。Abunmix 并非封闭平台，可应用于福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本，并有望在空间蛋白质组学、低表达标志物检测及疾病预后分析等领域发挥重要作用。
结论部分明确表示，本研究开发的 Abunmix 工具使得使用同种属抗体进行间接免疫染色成为可能。Abunmix 有效地分离了因抗体交叉反应而不可避免地产生的串扰信号。研究人员利用 Abunmix 仅使用兔源一抗就实现了小鼠脑的四重成像。随着 Abunmix 在消除抗体串扰方面的有效性得到证实，未来应用中需注意其与传统光谱解混假设的差异，以及图像获取过程中的实验因素影响。总体而言，Abunmix 作为一种有价值的工具，可广泛应用于各种荧光成像技术及生物疾病研究中。
