《Aging Cell》：Transcriptional Profiling at Single-Cell Resolution Reveals Diversity and Regulatory Networks of Primary and Secondary Senescent Cells
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衰老细胞在DNA损伤、癌基因激活和复制性耗竭等应激诱导的细胞周期阻滞后随年龄增长而累积。尽管其在组织修复和肿瘤抑制中发挥作用，但其持续存在的衰老相关分泌表型（SASPs)驱动年龄相关疾病的发生。衰老细胞群体的异质性，特别是原发性和继发性衰老之间的区别，在单细胞
衰老细胞在DNA损伤、癌基因激活和复制性耗竭等应激诱导的细胞周期阻滞后随年龄增长而累积。尽管其在组织修复和肿瘤抑制中发挥作用，但其持续存在的衰老相关分泌表型（SASPs)驱动年龄相关疾病的发生。衰老细胞群体的异质性，特别是原发性和继发性衰老之间的区别，在单细胞分辨率下仍未被完全理解。本研究中，研究人员通过X射线照射人肾上皮细胞建立原发性衰老模型，并通过将增殖细胞暴露于原发性衰老细胞的条件培养基建立继发性衰老模型。单细胞RNA测序揭示了结构化的转录轨迹，最终分别形成原发性(C5、C6和C8)和继发性(C3、C5和C7)衰老中不同的终末簇群。原发性衰老优先汇聚于细胞外基质(ECM)和纤维化相关程序，而继发性衰老表现出更强的炎症和信号响应性程序，两种情境均共享部分重叠的富集于应激反应和细胞因子相关转录模块。研究人员鉴定了区分原发性与继发性衰老细胞的亚型相关基因，以及候选转录调控因子——如HMGA1、NFKB1和JUNB——与保守性和情境特异性衰老程序相关。该研究为肾脏衰老和疾病相关的差异性共享分子特征提供了单细胞分辨率的转录图谱。
细胞衰老（cellular senescence）是一种异质性且依赖于环境的过程，在生命不同阶段发挥双重作用：早期通过抑制肿瘤发生和促进伤口愈合发挥保护作用，而衰老细胞（senescent cells, SnCs）的持续性累积则通过SASPs导致慢性炎症、组织功能障碍及纤维化等年龄相关病理改变。目前衰老研究领域面临的核心挑战在于SnC群体内部存在的固有异质性，这种异质性不仅阻碍了其分子特征的精确刻画，也可能限制衰老细胞清除药物（senolytic therapies）选择性清除有害SnCs的疗效。SnCs通常依据诱导方式、分子程序和生物学功能分为原发性和继发性两类亚型：原发性SnCs由DNA损伤等内在应激源直接诱导产生；继发性SnCs则通过原发性SnCs释放的SASP因子所驱动的旁分泌或全身性信号机制而产生。尽管已有研究提示VEGFR2（血管内皮生长因子受体2）、TGFBR1（转化生长因子-β受体1）和CCR2（单核细胞趋化蛋白1受体）等通路可能参与继发性衰老的调控，但这些通路究竟是驱动因素还是下游反应仍不清楚。此外，继发性衰老虽表现出稳定的生长阻滞和SASP分泌，但其空间传播范围较原发性衰老更为受限，提示两者在组织层面可能具有不同的影响。大多数研究仍主要聚焦于特定应激源诱导的衰老或群体水平的分析，原发性和继发性SnCs在单细胞水平的转录异质性及动态进展仍有待深入探索。
为填补这一空白，研究人员采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，系统解析了人肾上皮细胞中原发性和继发性SnCs的转录景观。原发性衰老通过X射线照射（10 Gy）诱导，继发性衰老则通过将增殖细胞暴露于SASP富集的条件培养基（conditioned media, CM）建模。该研究发表于《Aging Cell》杂志，为理解衰老亚型的分子机制及其在肾脏衰老与疾病中的作用提供了重要框架。
研究人员开展的主要关键技术方法包括：10× Genomics scRNA-seq平台对原发性和继发性衰老模型进行单细胞转录组测序；Slingshot算法进行伪时间轨迹重建以推断衰老进展路线；tradeSeq分析鉴定随伪时间动态变化的基因模块；基因集变异分析（GSVA）和基因集富集分析（GSEA）评估通路活性；pySCENIC进行单细胞调控网络推断以鉴定转录因子（TF）活性；利用公共小鼠肾脏空间转录组数据集（GSE252772，包含3周龄和92周龄样本）进行基因表达的空间验证；通过Kidney Precision Medicine Project（KPMP）肾脏组织图谱评估人类慢性肾脏病（CKD）中的临床相关性。
**研究结果部分如下：**
**单细胞RNA测序揭示原发性上皮细胞衰老的转录异质性及进展状态**
研究人员通过10 Gy X射线照射诱导人肾上皮细胞原发性衰老，以血清剥夺（0.01%血清，3天）的静止细胞作为对照，于照射后第10天进行scRNA-seq分析。衰老诱导的有效性经SA-β-gal活性增强、EdU
+增殖细胞减少、衰老/SASP相关基因（CDKN2A、CDKN1A、IL-1A、TNF-α和IL-6）上调、LMNB1表达降低以及CM中IL-6分泌增加等实验验证。无监督聚类识别出11个转录簇，排除主要由静止细胞组成的C2和C10后，剩余簇可分为非衰老（C4和C9）、中间态（C0、C1、C3和C7）和完全衰老（C5、C6和C8）三种主要细胞状态。非衰老簇表达MKI67、CCNA2等典型增殖基因；完全衰老簇则由照射细胞主导，表现CDKN2A、CDKN1A、TP53等衰老基因及NFKB1、SERPINE1、TNF、IL-6等SASP因子的强表达。GSVA显示中间簇呈渐进性衰老相关基因集激活，且完全衰老簇间存在功能差异：C5富集肾脏发育相关基因，C6和C8则显示DNA损伤应答和凋亡相关程序的增强。Slingshot轨迹分析识别出三条衰老进展谱系：终止于C5的DNA损伤相关谱系、终止于C6的核仁应激和核糖体活性谱系、以及终止于C8的SASP相关炎症标志物富集谱系。基因集评分支持从非衰老到完全衰老状态的逐步转变，表现为DNA修复能力下降和SASP相关特征增强。终末簇C8的晚期伪时间点基因包括ECM重塑/黏附基因（SPON2、LAMB3、LAMA3、LAMC2、THBS1、ITGAV、ITGB6、MMP7等）、屏障/细胞表面基因（DPP4、CLDN10、CLDN16、TFAP2B）以及炎症/应激相关基因（CCL2、CXCL1、CYP1B1、FTH1等），代表SASP活性高、ECM重塑富集的终末衰老程序。
**SASP相关继发性衰老的转录异质性与细胞状态**
为建模由旁分泌信号驱动的继发性衰老，研究人员将增殖的肾上皮细胞用来自原发性SnCs的CM（SCMT）处理，对照组则用来自静止细胞的CM（QCMT）处理。继发性衰老的诱导经SA-β-gal
+细胞增加、EdU
+增殖细胞减少、核HMGB1缺失细胞数减少、衰老相关基因（CDKN1A、IL-1A和IL-8）上调以及IL-6分泌升高验证。scRNA-seq分析识别出8个转录簇，分为非衰老（C2和C6）、中间态（C0、C1和C4）和完全衰老（C3、C5和C7）三类。非衰老簇C2显示DNA损伤检查点和修复通路的上调，而C6缺乏此反应，呈现相对抗衰老的表型；中间簇C0和C1表现免疫和炎症反应相关基因以及氧化应激、缺氧或DNA损伤等应激因子部分激活的通路，C4则显示衰老和癌症信号相关通路的激活以及DNA损伤/修复机制的上调，提示其为可能同时与衰老和癌症发展相关的过渡细胞簇。完全衰老簇上调CDKN2A、CDKN1A、TP53等衰老标志物及NFKB1和IL-6等SASP因子。GSVA显示完全衰老簇共享细胞因子受体活性和DNA损伤相关特征，但也存在亚型差异：C3富集p53相关基因集和IL-8产生，C5显示IL-6介导的信号传导，C7则表现缺氧相关基因集的富集。与原发性衰老终末簇相比，继发性衰老终末簇保留相对较高的DNA修复活性，且不显示肾细胞癌相关基因集的富集。Slingshot伪时间轨迹分析揭示四条通向不同终末状态（C3、C5、C6和C7）的谱系，其中终止于C6的谱系对应抗衰老轨迹。随伪时间进展，DNA修复逐步丧失而SASP相关特征增强。TradeSeq分析聚焦终止于C3的谱系4，显示细胞黏附/迁移相关通路、PI3K-Akt信号传导和黏着斑、以及ECM组织和受体酪氨酸激酶信号传导的动态转录转变；与原发性衰老谱系3相比，继发性谱系4除ECM-受体相互作用和ECM组织/周转外，还额外显示生长因子响应通路的更强富集。
**原发性和继发性衰老表现出不同但部分重叠的转录程序**
研究人员直接比较了原发性和继发性衰老的终末簇，以验证伪时间分析推断的终末轨迹在簇水平转录架构中的反映。原发性衰老中：C5表现JAK-STAT信号传导（IL15、EGFR、PIAS1）、肾细胞癌（RAPGEF1、SOS1、PIK3B、GAB1、ETS1）和细胞生长调控信号组分（PTK2、HSPG2、PTPRJ）的上调；C6显示核糖体和核仁应激相关基因（RPS3、RPL29、RPL5、RPL11等）、氧化应激（SOD1和B2M）和铁代谢（FTL和FTH1）的增加；C8则表现强烈的ECM重塑活性，包括胶原蛋白家族成员和基质重塑因子（COL28A1、COL1A1、COL4A1、THBS1和TGM2等）。继发性衰老中：C3显示明显的炎症/SASP相关特征，标志为CXCL8、BMP2、CSF2、IL-6、STAT3和PYCARD基因；C5表现应激和内质网（ER）相关信号组分（HSPA5）的上调；C7则显示核糖体和钙信号相关特征，涉及CALM1、CALM3和FKBP1A，与原发性C6的核仁应激样特征部分重叠。通路分析进一步突显功能分歧：C5（原发性）富集肾细胞癌、Wnt信号通路和JAK-STAT信号通路等癌症相关通路，而C5（继发性）增加氧化应激和炎症相关通路；C6（原发性）富集铁稳态，C7（继发性）富集钙信号和离子通道调控；C8（原发性）高度富集ECM重塑通路，C3（继发性）则优先富集脂质代谢、细胞对饥饿的反应和细胞因子产生通路。尽管存在这些区别，C5在两种衰老中均表现DNA损伤应答、细胞周期和DNA修复通路上调；C6（原发性）和C7（继发性）共享核糖体相关信号传导；C8（原发性）和C3（继发性）富集凋亡和血管生成相关通路。GSEA进一步证实：两种衰老中的C5均富集刺激检测；C6（原发性）和C7（继发性）独特显示核糖体相关通路的上调；C8（原发性）和C3（继发性）强烈富集细胞因子-细胞因子受体相互作用。
**原发性和继发性衰老中亚型特异性基因的鉴定与验证**
通过比较原发性和继发性衰老的差异表达基因（DEGs），研究人员鉴定出833个原发性特异性基因和323个继发性特异性基因。为聚焦与衰老传播最相关的终末状态，优先分析了代表最高SASP活性谱系终点的簇——原发性衰老的C8和继发性衰老的C3。原发性C8显著上调ECM重塑（COL1A1和ITGA2）、凋亡过程（FAS）、TGF-β信号传导（HPGD、LTBP2）和代谢失调（PYGB）相关基因。伪时间轨迹分析证实这些基因沿谱系3向终末终点逐步上调。继发性C3则上调炎症/SASP相关基因（CXCL8、CSF2和BMP2）和ECM糖蛋白（LAMA4）。为评估体内相关性，研究人员分析了比较幼龄（3周）和老年（92周）小鼠肾脏的公共空间转录组数据集（GSE252772）：空间映射显示Ltbp2在老年肾脏中表达增加，与伪时间分析中其向原发性衰老终末状态渐进诱导一致；Cxcl1/Cxcl2（人CXCL8的小鼠同源物，代表性继发性衰老特异性DEG）则在老年肾组织中表现年龄相关的炎症/分泌程序增强。通过KPMP肾脏组织图谱进一步评估CKD中的临床相关性：纤维化富集区域（由ACTA2和COL1A1的空间共表达定义）显示多种原发性衰老相关DEG（包括LTBP2）表达增加，而继发性衰老相关DEG则表现更异质的空间富集。
**跨原发性和继发性衰老的共享转录调控因子和保守通路**
研究人员整合差异表达、伪时间动态、空间验证和转录因子活性分析，以阐明跨衰老亚型保守的转录程序。比较原发性（C5、C6、C8）和继发性（C3、C5、C7）衰老的衰老簇，鉴定出4604个重叠DEGs，其中17个基因在两种衰老中一致上调，包括IGFBP5、LAMC2、KRT7、ITGB6和TFAP2B。IGFBP5、KRT7、ITGB6和TFAP2B主要富集于终末簇C8（原发性）和C3（继发性），而LAMC2在原发性C8以及继发性C3和C5中均升高。伪时间分析显示这些共享基因沿谱系3（原发性）和谱系4（继发性）逐步诱导，表明共享特征与成熟衰老而非过渡中间体相关。功能注释将LAMC2和ITGB6与ECM重塑和肾脏疾病进展关联，TFAP2B则与凋亡相关通路关联。SCENIC分析进一步鉴定HMGA1、NFKB1和JUNB为两种衰老亚型中活跃的转录调控因子：HMGA1活性在C6（原发性）和C7（继发性）中突出，与核糖体生物发生和代谢特征一致；NFKB1活性在C8（原发性）和C3（继发性）中富集，调控AGE-RAGE信号传导、TNF介导的炎症和ECM组织；JUNB则显示亚型差异性激活，在C8（原发性）和C5（继发性）中活性较高。网络可视化突显部分重叠的TF-靶标关系，例如关键纤维化相关ECM重塑基因LAMC2被预测为原发性衰老中NFKB1的靶标。
**讨论部分总结**
研究人员在讨论中强调，细胞衰老是一种异质性且依赖条件的过程，SnCs的累积通过持续性SASP分泌导致慢性炎症、组织功能障碍和纤维化。尽管SnCs对周围细胞的影响已得到充分记录，但原发性和继发性衰老亚型对肾脏疾病和衰老的特异性贡献仍知之有限；当前大多数衰老治疗策略广泛靶向衰老，忽视了SnC群体内部的多样性或原发性和继发性衰老的潜在不同作用。
该研究通过单细胞转录组分析系统表征原发性和继发性衰老，揭示了不同的谱系架构、终末状态和调控网络。分析表明，原发性和继发性衰老并非均一状态，而是包含结构化的轨迹，最终形成转录和功能上不同的程序。由DNA损伤直接诱导的原发性衰老优先汇聚于基质重塑和纤维化相关转录程序，终末原发性衰老簇富集ECM组分和重塑因子（如COL1A1、ITGA2和LTBP2）以及TNF和TGF-β信号相关通路，与衰老和疾病肾脏中观察到的纤维化重塑过程一致。相反，由SASP介导的旁分泌信号诱导的继发性衰老表现出更强的炎症和信号响应性程序，终末继发性簇以细胞因子和免疫调节基因（如CXCL8、CSF2、BMP2和LAMA4）的富集为特征，与炎症微环境的放大一致。
伪时间轨迹分析进一步揭示，原发性和继发性衰老均通过可识别的中间态进展至终末表型。原发性衰老轨迹终止于DNA损伤（C5）、核糖体应激（C6）和ECM重塑及纤维化特征（C8）；特别是终止于C8的谱系3显示ECM组织和细胞群体增殖负调控的富集，提示这些原发性SnCs积极重塑ECM，可能放大年龄相关纤维化和炎症。继发性SnCs则显示与炎症（C3）、IL-6信号传导（C5）和核糖体/p53应激（C7）相关的结构化转变。尽管存在分歧，原发性和继发性衰老在部分重叠的转录特征上趋同，包括应激反应p53信号传导、细胞因子-受体相互作用和凋亡相关过程等共享通路。共同基因如IGFBP5、LAMC2、KRT7、ITGB6和TFAP2B在两种衰老类型的终末簇中富集，并在CKD纤维化区域空间富集，提示不同衰老轨迹可能汇聚于与组织重塑和炎症信号相关的保守晚期转录架构。
调控网络分析进一步突显HMGA1、NFKB1和JUNB等部分共享的上游转录因子：JUNB和NFKB1活性优先与SASP和炎症通路关联，HMGA1则与核仁应激和核糖体活性关联；这些调控因子表现情境依赖性活性而非跨亚型的统一控制。此外，LAMC2作为两种衰老类型共享的ECM相关基因，被预测为原发性衰老中NFKB1的特异性靶标，可能促进炎症和组织重塑相关程序。研究人员特别指出，鉴于SCENIC网络重建的推断性质，这些调控关系应被解释为推定性关联，需要未来功能验证。
为确保共享转录特征非由数据集分离或批次特异性效应驱动，研究人员还进行了跨所有实验条件（QUI、IR、QCMT和SCMT）的整合分析，共享标志物在整合后仍富集于衰老簇，支持保守转录模块跨实验条件的稳健性。
研究结论指出，该工作提供了区分原发性和继发性衰老的单细胞分辨率框架，同时定义了两种情境共享的保守转录核心。这些发现为未来功能和转化研究奠定了基础，旨在选择性调控与原发性和继发性衰老亚型相关的组织重塑和炎症，以干预肾脏衰老和疾病。然而，研究也存在局限性：结论主要基于转录组推断，尽管空间转录组分析和有限蛋白水平测量提供补充支持，候选调控因子和标志基因的功能验证仍有必要建立因果性；此外，从中间态到终末衰老状态的分子机制，特别是继发性衰老中的机制，仍有待阐明。原发性衰老簇C5中长链非编码RNA（lncRNAs）的富集提示了潜在的调控层面，但其功能角色尚需进一步研究。
