类器官是由干细胞来源的三维（three-dimensional, 3D）培养模型，能够高度模拟人体组织的结构和细胞复杂性，为生物医学研究提供具有生理相关性的平台。该技术克服了二维（two-dimensional, 2D）培养的局限性，减少了种属特异性差异，在接近生理条件下研究病毒-宿主相互作用和致病机制方面具有重要价值。本综述系统概述了基于类器官的病毒学研究关键进展，包括难培养病原体如人鼻病毒C（human rhinovirus C, HRV-C）和诺如病毒（norovirus, NoV）的传播，以及病毒感染致病机制的新见解，涵盖严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）和寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）感染，并探讨了类器官在抗病毒药物筛选和临床前评估中的转化应用价值。本研究进一步考察了类器官在肿瘤和神经疾病建模中的应用，比较了不同细胞来源的优劣势，并讨论了其与CRISPR基因编辑和3D生物打印等新兴技术的整合潜力。此外，本综述构建了从分子机制到临床实践的转化路径，以促进疾病机制研究并加速药物和疫苗开发。最后，本研究提出了应对现有挑战（如缺乏免疫组分和血管化不足）的整体策略，旨在推动类器官技术在生命科学和转化医学中的广泛应用。
1 引言
类器官技术的探索旨在建立能够真实再现人体组织生理和病理特征的体外模型，这一直是生物医学研究的核心目标。传统二维细胞培养缺乏组织异质性和微环境复杂性，无法满足病毒嗜性研究对组织特异性细胞和微环境的需求，也无法满足免疫应答研究对实质细胞与免疫组分协同作用的要求。种间差异限制了动物模型的使用，其病毒嗜性谱和免疫应答模式与人类不匹配，导致基础研究向临床转化频繁失败。类器官作为突破性的体外培养系统，已成为连接基础研究与临床实践的桥梁。类器官定义为来源于干细胞、能够自我组织并分化为模拟体内器官解剖和功能特征的三维细胞聚集体。其具有靶器官特异性多细胞组成、天然组织样空间组织以及组织特异性生理和病理模拟能力，在病毒嗜性和免疫应答研究中展现出显著优势。
21世纪以来，类器官技术经历了多个里程碑式发现。2009年，Hans Clevers团队首次成功从小鼠肠道干细胞构建肠道类器官（intestinal organoids, IOs），为类器官培养系统的建立奠定基础。2013年，研究人员进一步开发出人类肠道类器官（human intestinal organoids, HIOs），证明了类器官在人类相关研究中的可行性。后续年份持续取得突破：脑、肝、肺和肿瘤类器官的成功构建拓展了应用范围；2017年患者来源类器官（patient-derived organoids, PDOs）的出现使个性化医学研究成为可能；类器官与微流控芯片、单细胞测序等技术的整合进一步增强了其模拟能力和研究价值。尽管取得这些进展，研究仍面临挑战，包括组织复杂性重现不完全、培养成本高和缺乏标准化实验方案，限制了类器官的广泛临床应用。
2 类器官技术发展历程
类器官是由胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）、诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）和成人干细胞（adult stem cells, ASCs）来源的复杂细胞聚集体，通过3D体外培养实现自我组装和自我更新，能够高保真地复制特定器官的细胞组成和功能特征。
科学家早在20世纪末期就开始探索体外模拟器官发育复杂过程的方法。干细胞的潜能和自我更新能力为类器官生成提供了基础。自2009年Hans Clevers团队成功培养IOs以来，类器官技术迅速发展，在疾病建模、药物筛选和再生医学中展现出巨大潜力。基于该技术，iPSCs和ESCs通过先进技术进一步分化为心脏、肝脏、肺、肾脏和胰腺等各种组织特异性类器官。2011年，肠道和视网膜类器官在体外成功培养。IOs表现出由极化柱状上皮组成的3D绒毛样结构，而来源于小鼠ESCs的视网膜类器官则显示出视网膜和视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）的特征。
2013年，研究人员成功从人类多能干细胞（human pluripotent stem cells, hPSCs）生成脑、肝、肾和胰腺类器官。2014年，前列腺和肺类器官从ASCs培养成功。2015年，乳腺、输卵管和海马类器官成功开发。2020年，研究团队建立了蝙蝠IOs并应用于SARS-CoV-2感染研究；同年，研究人员将类器官技术扩展至爬行类组织，建立了多种蛇类的毒腺类器官长期培养。2021年，Hans Clevers团队开创性开发了宫颈类器官，随后用于研究女性生殖系统；同年心脏类器官也被成功创建，能够复制人类心脏早期发育阶段。2022年，美国食品药品监督管理局（US Food and Drug Administration, US FDA）批准首个基于"类器官芯片"数据的新药进入临床试验（NCT04658472），表明类器官可能替代传统模型进行药物评估。2023年至2026年间，高保真耳蜗类器官、可扩增胰腺类器官、血管化免疫完备皮肤类器官以及工程化血管化视网膜类器官等里程碑进展持续拓展了应用范围并显著提升了生理保真度。
3 类器官的构建及其优势与局限性
类器官可从iPSCs、ESCs和ASCs获得，各有其优势、局限性及应用特点。iPSCs和ESCs具有定向分化为几乎所有人体细胞类型的潜能，包括来源于三个主要胚层（内胚层、中胚层和外胚层）的细胞。诱导不同类器官需要精确激活或抑制特定信号组合：Shh信号驱动神经类器官中腹侧前脑形成；BMP4和Wnt3a组合促进小脑分化；肝类器官构建常采用"肝母细胞"策略，依赖FGF/BMP信号使肝内胚层细胞与中胚层和内皮细胞共聚集；肾类器官一般先用Activin A诱导中胚层，再用FGF9或BMP4和FGGF2诱导中胚层，后续添加视黄酸、BMP2和Activin A诱导输尿管芽，或在中间中胚层阶段添加视黄酸和FGF9诱导后肾间充质。
ASCs来源的另一类类器官构建相对简单、更易获取。尽管不同组织的培养系统各异，但通常依赖几个核心信号通路的协调调控。Wnt/β-catenin通路（常用R-spondin-1、Wnt3a和CHIR99021等激活）是维持干细胞自我更新的关键；同时需抑制促分化信号，如使用Noggin、A83-01或SB431542阻断BMP和TGFβ等通路；此外常补充FGF家族成员（如FGF10）以进一步支持细胞生长和维持。此类类器官能够再现其来源组织的发育阶段，更接近成人型类器官。相比之下，ESCs和iPSCs的胚胎起源使其来源的类器官更接近胎儿阶段，许多生理特征尚未成熟。
实验设计需根据特征策略性选择类器官模型。ESCs因其广泛的塑性和分化潜能，在组织工程中备受重视。iPSCs规避了伦理问题和免疫排斥风险，因其可从成体细胞重编程获得。ASCs来源广泛且成瘤倾向低，可从多种亲代组织获取，便于建立全面的生物样本库，且这些培养物保持遗传稳定性。
4 类器官的多领域应用
4.1 类器官在病毒学研究中的应用
类器官技术为病毒学研究带来革命性突破。诺如病毒（NoV）和人鼻病毒（HRV）等在传统永生化细胞系中难以培养的病原体，现可在类器官模型中成功传代。类器官还可用于模拟病毒感染机制、宿主-病毒相互作用、抗病毒药物筛选和疫苗开发。
相比传统研究模型，类器官具有两个显著优势：其一，其表面分子表达谱更准确地再现人体组织特征，而永生化细胞系或动物模型中的显著表达差异可能导致对病毒受体识别机制的误读；其二，类器官独特的极化结构为研究病毒突破上皮屏障的策略提供了不可替代的模型，这一关键特征在永生化细胞系中完全缺失。
在各类类器官模型中，ASCs来源的类器官展现出独特优势。这些类器官完全保留了病毒感染主要靶标——上皮细胞的生物学特性，因其培养周期短、分化潜能高，成为研究病毒入侵抑制机制的理想平台。目前，基于ASCs的类器官模型在病毒学研究中已显示出重要价值，特别是在推进SARS-CoV-2、肠道病毒、ZIKV和HRV等主要病原体感染机制的理解方面。
4.1.1 SARS-CoV-2
SARS-CoV-2采用双进入机制，依赖血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2, ACE2）/TMPRSS2介导的膜融合途径和组织蛋白酶L（cathepsin L, CTSL）依赖的内吞途径。这一特征直接暴露了传统单通路、单细胞系模型在临床转化中的局限性。早期疫情中，Vero细胞（仅支持CTSL依赖的内吞途径）和Calu-3细胞（仅支持TMPRSS2介导的融合途径）的单向感染性特征导致了氯喹可实现广谱抗SARS-CoV-2效应的误读，促使全球10余项氯喹治疗临床试验过早启动，延误了有效治疗的采用并导致部分患者出现心律失常等严重不良反应。
类器官相关研究的关键临床洞见是确认了SARS-CoV-2进入途径的组织特异性分布：在鼻黏膜类器官中，病毒进入主要依赖TMPRSS2介导的膜融合途径（对应轻度上呼吸道感染）；而在下呼吸道肺泡类器官中，CTSL依赖的内吞途径占主导（对应严重肺部感染）。这一区别在肺组织中尤为明显，特别是在TMPRSS2低表达的二型肺泡上皮细胞中，CTSL依赖途径作为主要进入机制。Omicron变异株表现出嗜性转变，对TMPRSS2依赖性降低，对CTSL依赖性增加。
肺类器官能够稳定复制人体肺上皮的极化结构和核心生理功能（如黏液分泌和纤毛摆动）。成熟气道样和肺泡样类器官系统可模拟肺组织的细胞异质性，已成功识别纤毛细胞的优先感染和上皮屏障破坏机制，为重症病例病理学提供关键见解，并准确捕捉Omicron变异株感染气道类器官效率比祖先株高5-10倍的特征。
4.1.2 肠道病毒
2017年，Coyne团队成功利用ESCs构建HIOs，表型特征确认这些类器官包含杯状细胞、Paneth细胞和肠内分泌细胞等多种肠道细胞类型，细胞组成与人类小肠组织的一致性达72%。后续易感性研究进一步证明HIOs支持三种临床常见肠道病毒的感染：埃可病毒11（echovirus 11, E11）、柯萨奇病毒B（coxsackievirus B, CVB）和肠道病毒71（enterovirus 71, EV71）。关键发现是病毒在HIOs中具有严格的细胞类型特异性：E11优先感染吸收性肠细胞和肠内分泌细胞，损害肠道吸收功能；而EV71主要在杯状细胞中复制，导致腹泻和黏液分泌异常等临床症状。
研究团队开发的优化HIO模型中，肠上皮细胞占细胞群体的80%以上，保留四种成熟肠道细胞类型，肠道病毒感染特征与儿科患者肠道组织的一致性提升至85%。利用该优化系统，研究人员确认EV71和柯萨奇病毒A16感染可快速激活IFN-III、ISGs以及IL-6和TNF-α等促炎细胞因子参与的信号通路，通路活性在感染后72小时达峰随后逐渐下降，阐明了此类肠道感染自限性的分子机制。
4.1.3 乙型肝炎病毒
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是全球重大公共卫生威胁。近年来，肝类器官技术成功克服了传统HBV研究模型的诸多关键局限性。目前已建立两种极具前景的研究系统：Nie团队开发的iPSC来源肝类器官，以及de Crignis团队创建的ASC来源肝类器官。两种系统均能支持完整的HBV生命周期，值得注意的是ASC来源肝类器官可建立患者特异性模型并用自体病毒再感染，对筛选影响个体HBV复制的独特宿主因子具有重要价值。
肝类器官是动物模型和肝癌细胞系等传统临床前研究平台的革命性替代方案。Fialuridine事件暴露了传统研究系统的致命局限性：该药物虽成功通过所有临床前评估并在降低HBV DNA载量方面显示出显著疗效，但在II期临床试验中导致七名参与者出现严重肝毒性。后续调查证实其毒性源于与人类线粒体特异性表达的核苷转运体的相互作用，这一机制在先前的非人模型和转化细胞系检测中未被检出。值得注意的是，原代肝类器官在Fialuridine处理后表现出显著且可量化的毒性反应，而肝癌来源的HepG2细胞则无不良影响。
4.1.4 人诺如病毒
人诺如病毒（human norovirus, HuNoV）是全球流行性散发急性胃肠炎的主要原因。Mary等人（2016年）建立的模拟肠道细胞异质性的HIOs实现了HuNoV的稳健体外培养。后续基于HIOs的研究阐明了毒株特异性进入途径：GII.4利用内吞体酸化途径，内吞体酸化至pH≈5.5-6.0触发病毒衣壳构象变化介导病毒基因组释放至胞质；而GII.3依赖胆汁酸和酸性鞘磷脂酶生成的神经酰胺。
4.1.5 寨卡病毒
寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）是一种蚊媒黄病毒，可实现垂直传播。研究人员利用人滋养层干细胞构建的滋养层类器官忠实再现了天然滋养层细胞的核心特征，包括分泌功能、分子表达谱和合胞体化，并被证明可有效建模ZIKV感染引起的胎盘结构和功能损伤。
4.1.6 其他病毒
类器官作为创新精密的模型，已广泛用于多种病毒的研究，包括单纯疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）、人鼻病毒（human rhinovirus, HRV）、轮状病毒（rotavirus, RV）、猴痘病毒（monkeypox virus, MPXV）和呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus, RSV）等。
4.2 类器官在肿瘤学中的应用
4.2.1 类器官平台在早期肿瘤研究中的应用
在胃类器官中，ARID1A基因缺失诱导细胞形态异型性并激活FOXM1-BIRC5信号通路，赋予增强的增殖能力和抗凋亡特性，且这些类器官对BIRC5抑制剂表现出显著敏感性。结直肠癌类器官研究发现APC和TP53双突变可将NOTUM蛋白从肿瘤抑制因子转化为促瘤酶，药理学抑制NOTUM活性可有效阻断腺癌进展。非小细胞肺癌PDOs可在可检测的耐药突变出现前预测患者对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）的耐药性。
4.2.2 类器官平台在肿瘤转移研究中的应用
利用微流控芯片基础的"肿瘤芯片"系统，研究人员可模拟肿瘤细胞从原发部位经循环系统向远处器官播散的完整动态过程。血管化类器官模型可实现对肿瘤细胞跨内皮屏障外渗和随后微转移灶形成的连续监测。
4.2.3 类器官平台在肿瘤治疗研究中的应用
PDOs可有效模拟个体肿瘤药物反应，为精准医学和临床试验入组提供可靠依据。在靶向治疗研究和耐药机制研究中，PDOs被广泛用于药物筛选。胃类器官长期暴露于HER2抑制剂后表现出间充质-上皮转化原癌基因（mesenchymal-epithelial transition proto-oncogene, MET）信号通路的代偿性激活，联合MET抑制剂可恢复药物敏感性，该发现随后在类器官来源的异种移植模型中得到验证。
4.3 类器官在神经疾病中的应用
4.3.1 多发性硬化
罗氏团队构建了髓鞘化人脑类器官与小胶质细胞的共培养系统，以阐明MS中神经-免疫相互作用和髓鞘再生失败的核心机制。该模型可再现人脑髓鞘结构，小胶质细胞保持生理免疫应答能力并与人类中枢神经系统微环境一致。实验证实小胶质细胞耗竭显著降低类器官内的髓鞘再生率。关键突破是在预后最差的原发性进展型MS（primary progressive MS, PPMS）患者来源PDOs研究中取得：PPMS类器官中细胞周期抑制因子p21表达显著下调，导致少突胶质细胞分化受损；外源性给予p21激动剂后，类器官内少突胶质细胞分化率从12%提升至27.6%。
4.3.2 帕金森病
患者特异性iPSCs衍生的中脑类器官可再现PD的关键早期细胞病理特征，包括线粒体功能障碍、异常能量代谢和多巴胺能神经元发育障碍。携带LRRK2 G2019S、PINK1或SNCA突变的类器官模型中观察到线粒体膜电位降低、氧化磷酸化效率下降和突触活动减弱。
4.3.3 自闭症谱系障碍
ASD患者iPSCs分化构建的脑类器官模型可准确再现疾病相关关键表型：携带SHANK3基因突变的脑类器官表现出NPC增殖异常、神经元成熟延迟、微柱状结构破坏和突触密度显著降低。单细胞RNA测序验证了这些模型的可靠性，确认其基因表达谱与ASD患者特定脑区的转录组差异一致。
5 类器官与其他技术的联合应用
5.1 腺病毒介导的基因递送评估
腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）载体，特别是重组AAV（recombinant AAV, rAAV）载体，因其独特的生物学特性成为基因治疗中备受青睐的工具。AAV2-7m8在视网膜类器官中表现出极高的转导率，强启动子如CMV和CAG可驱动广泛细胞类型的转导，而光感受器特异性启动子如GRK1可精确将转基因表达靶向光感受器样细胞的外层。
5.2 共培养系统
研究人员建立了将肝类器官与同源hPSCs分化的巨噬细胞共培养的可靠体外共培养模型，用于探究HCV、非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）和宿主-病毒相互作用的机制。Takabe等人通过将iPSC来源的肝细胞与人脐静脉内皮细胞和间充质干细胞混合于Matrigel中，成功生成iPSC来源的肝芽（iPSC-derived liver buds, iPSC-LBs）。
5.3 CRISPR-Cas9
在冠状病毒研究中，可通过瞬时转染编码Cas9-EGFP的质粒与sgRNA产生突变克隆类器官，以评估与SARS-CoV-2复制周期相关的单个宿主因子。相关研究已在IO突变体中证实ACE2和DPP4分别是SARS-CoV/SARS-CoV-2和中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV）的进入受体，且SARS-CoV-2在IOs中的复制特别依赖于细胞表面蛋白酶TMPRSS2。ADP核糖基化因子6（ADP-ribosylation factor 6, ARF6）是SARS-CoV-2复制后进入阶段涉及的宿主因子。此外，核转录因子昼夜节律相关转录抑制因子（circadian associated repressor of transcription, CIART）已被鉴定为SARS-CoV-2感染的关键调节因子，敲除CIART可通过下调视黄醇X受体通路阻断SARS-CoV-2感染。
5.4 生物3D打印
季节性流感病毒A（influenza A virus, IAV）感染已成功通过3D打印细胞水凝胶建模。利用患者原发结直肠癌来源的肿瘤进行3D生物打印复制体内非均一肿瘤区域的研究证实，长期建立的微肿瘤保留增殖细胞以及坏死和缺氧区域。
5.5 条件重编程
利用条件重编程（conditional reprogramming, CR）和类器官技术，已成功建立正常人肾近端小管上皮细胞的长期培养系统。CR有助于维持细胞系的分化潜能、DNA修复能力和细胞类型特异性功能标志物的表达，包括ACE2蛋白。
6 类器官的局限性及临床转化瓶颈
6.1 模拟3D微环境和多细胞相互作用的缺陷
6.1.1 重建免疫微环境的系统性不足
当前类器官模型在系统重建免疫微环境复杂性方面仍存在局限。SARS-CoV-2变异株可通过逃避中和抗体实现免疫清除逃逸，模拟感染期间免疫细胞的招募、激活和功能动态尤为关键。肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment, TIME） classification into immune-inflamed, immune-excluded, and immune-desert types reveals differences in key features such as immune cell infiltration levels, neoantigen expression, and PD-L1 expression, thereby influencing responses to immunotherapies。
6.1.2 缺乏功能性血管化及相关屏障
肿瘤生长和转移高度依赖血管生成。缺氧是肿瘤微环境的普遍特征，促进肿瘤进展和治疗耐药，并通过EV介导的细胞间通讯调控肿瘤细胞和周围微环境。缺乏功能性血管化的类器官模型无法准确模拟肿瘤内的缺氧梯度和营养递送，导致对治疗反应的不准确评估。病毒在体内的传播常通过循环系统实现，缺乏功能性血管的体外模型难以模拟病毒在血液中的播散、病毒-内皮细胞相互作用以及感染引发的血管炎症反应。
6.2 标准化和可重复性
类器官生成过程涉及多种起始细胞来源、不同培养基配方和细胞外基质选择，均可导致类器官形态、功能和分子特征的变异性。目前尚未建立普遍适用的质量控制标准来评估类器官成熟度、功能性和与体内组织的相似性。
6.3 监管路径和成本效益
从监管角度，尽管类器官已获得US FDA和欧洲药品管理局（European Medicines Agency, EMA）等机构的认可，作为新途径方法学的一部分，其数据在非临床毒性研究和机制研究中的接受度日益提高，但这些模型尚未被系统整合到药物评估的核心决策框架中。在成本和可扩展性方面，类器官培养仍属于资源密集型，依赖昂贵的基质、定制细胞因子组合和长期分化方案。
7 结论与展望
本综述系统考察了类器官技术在病毒学、肿瘤学和神经疾病研究中的关键应用，凸显了其作为连接基础研究与临床转化的新型体外模型的价值。类器官为深入探究病毒复制机制和组织嗜性提供了重要平台，成功应用于SARS-CoV-2和肠道病毒复制动力学研究、NoV稳定体外复制模型建立、ZIKV神经致病机制和胎盘感染阐明，以及HBV完整生命周期和HRV-C复制过程的新见解。在肿瘤学研究中，PDOs能够高度再现肿瘤异质性和药物反应特征，为解析早期致癌机制、识别耐药相关靶点（如ARID1A、NOTUM和PI3K信号通路）以及个性化药物敏感性检测、转移风险预测和临床前研究提供优势。对于神经疾病，脑类器官和中脑类器官等模型已再现MS脱髓鞘、PD多巴胺能神经元损伤和ASD神经发育异常等核心病理特征。
类器官技术的核心优势在于其患者特异性、高度组织模拟性和实验可操作性，有效弥补了传统二维细胞培养缺乏微环境支持和动物模型存在种间差异的局限。然而，该技术仍面临标准化不足、免疫细胞和血管结构有限、培养周期长和成本高等挑战。未来发展方向应聚焦于精准化、整合化和临床转化三个维度：技术层面需推进培养系统的标准化和自动化；功能拓展层面需整合共培养系统、微流控芯片、单细胞测序和人工智能等多学科技术；临床转化层面需加速将类器官技术纳入临床路径，建立基于PDO药物敏感性检测的临床指南。
