综述：N6-甲基腺苷修饰在健康与疾病中的作用

《MedComm》：The Role of N6-Methyladenosine Modification in Health and Disease

越来越多的证据表明，N6-甲基腺苷（m6A）作为真核生物中最普遍的内部RNA修饰，是调控RNA代谢的关键表观转录组学调节因子。这种转录后修饰通过调节可变剪接、核输出、稳定性及翻译过程，进而调控多种生理进程。值得注意的是，m6A相关调控因子（写入蛋白/擦除蛋白/读取蛋白）的失调与包括代谢紊乱和癌症在内的多种疾病密切相关。尽管基于m6A的新兴治疗策略发展迅速，但仍迫切需要弥合基础表观转录组学与临床应用之间的鸿沟。本综述系统阐述了m6A介导的表观转录组调控的最新进展，重点关注其在维持细胞稳态与调控失衡驱动疾病进展中的双重作用，专门探讨了m6A对线粒体重塑的调控机制，并概述了m6A图谱绘制技术及靶向m6A调控因子的小分子抑制剂。此外，研究人员深入分析了靶向m6A修饰的现有局限性与治疗潜力。作为连接表观转录组学与医学的关键枢纽，m6A修饰为开发复杂人类疾病的精准干预策略提供了全新视角。

1 引言

“表观转录组”概念于2012年首次提出，强调化学RNA修饰在不改变核苷酸序列的前提下调控RNA代谢的核心作用。目前已鉴定出超过170种转录后修饰，其中N⁶-甲基腺苷（m⁶A）是RNA中分布最广的修饰之一，广泛存在于各类生物中。m⁶A修饰最早于20世纪70年代被发现，在哺乳动物中所有腺苷中的占比为0.15%–0.6%。2010年代初，脂肪量与肥胖相关蛋白（FTO）和AlkB同源蛋白5（ALKBH5）被鉴定为m⁶A特异性去甲基化酶，打破了RNA修饰静态且不可逆的传统认知。与此同时，甲基转移酶样3（METTL3）-METTL14-Wilms瘤1相关蛋白（WTAP）复合物的发现确立了m⁶A的动态“写入”体系，而YTH结构域包含蛋白则成为进化上保守的“读取”因子，通过解码m⁶A标记调控RNA剪接、核输出、稳定性与翻译。这些突破结合m⁶A测序（m⁶A-seq）等高通量技术的发展，推动了表观转录组学的复兴。m⁶A研究的历程体现了其从生化现象到调控发育与疾病发生核心机制的转变。近期研究进一步拓展了m⁶A在连接RNA生物学与机体生理及疾病中的多重作用。转录组-wide定位显示m⁶A沉积并非随机，而是呈现精确的时空模式，响应细胞信号、代谢状态与环境压力精细调控RNA代谢。在生理层面，m⁶A协调干细胞多能性维持、昼夜节律调控及免疫细胞分化等关键进程，通常通过m⁶A修饰转录本与其读取蛋白的上下文依赖性互作实现。反之，m⁶A写入蛋白、擦除蛋白或读取蛋白的失调已被机制性证实与癌症进展、代谢综合征、心血管病变及自身免疫疾病等病理状态相关。例如，METTL3介导的异常m⁶A通过增强癌基因翻译促进肿瘤发生，而白血病中FTO过表达则通过擦除m⁶A依赖的抑癌信号驱动治疗抵抗。单细胞m⁶A测序、空间表观转录组学及CRISPR编辑的甲基化开关等新兴工具正解析组织内m⁶A异质性如何贡献于疾病进展或恢复。尽管m⁶A研究快速扩展，该领域仍面临重要挑战，如机制洞察、技术进步与疾病导向的发现常孤立讨论而非整合。因此，系统总结m⁶A调控的分子基础及其疾病相关性对指导未来应用至关重要。本综述总结了m⁶A调控的核心机制、m⁶A甲基化组的主要分析技术，讨论了m⁶A的生理功能及其在主要疾病中的失调，重点关注代谢紊乱、癌症、神经与炎症性疾病、器官损伤及线粒体重塑，最后评估了靶向m⁶A轴的治疗策略，包括小分子抑制剂与表观转录组编辑方法，并指出未解决的问题、转化挑战与未来方向，旨在为理解m⁶A的生物学与临床意义提供更新框架。

2 m⁶A修饰的分子机器与调控机制

2.1 m⁶A由写入蛋白安装

m⁶A通常由多组分甲基转移酶复合物（MTC）安装，该复合物包含催化亚基METTL3及调节亚基（包括METTL14、WTAP、VIRMA、HAKAI、ZC3H13和RBM15/15B）。METTL14与WTAP作为直接结合METTL3的组分，分别增强METTL3催化活性及将其招募至核斑点。WTAP-VIRMA直接与RGG基序相互作用阻止dsDNA结合，维持METTL3-METTL14的RNA甲基化活性。HAKAI缺失导致MTC多个亚基不稳定，抑制m⁶A沉积，并可能作为连接HIZ1（植物ZC3H13同源物）与核心m⁶A写入组分的桥梁。ZC3H13与RBM15及WTAP相互作用，作为两者间的连接子稳定MTC并促进RNA上m⁶A沉积。RBM15/15B结合RNA并将MTC招募至RNA特定位点。不同于METTL3/14，METTL16作为甲基转移酶家族成员可独立控制mRNA的m⁶A修饰，在核内作为m⁶A写入蛋白将m⁶A沉积至数百个特异性RNA靶标。近期，METTL4/7A/7B等可引发mRNA m⁶A甲基化的METTL家族蛋白进入研究视野，但其参与m⁶A沉积的具体机制仍需探索，m⁶A写入蛋白的类型与功能正不断丰富。

2.2 m⁶A由擦除蛋白消除

m⁶A可通过FTO与ALKBH5依赖Fe²⁺和α-酮戊二酸的去甲基化作用转化为腺苷（图1）。FTO是首个被发现的m⁶A擦除蛋白，其缺失显著升高总m⁶A水平。值得注意的是，FTO可去除多种甲基修饰，包括3-甲基尿苷（m³U）、N¹-甲基腺苷（m¹A）及N⁶,2’-O-二甲基腺苷（m⁶Am），因此需从整体角度考量FTO的非特异性去甲基化活性。ALKBH5是另一种m⁶A去甲基化酶，可氧化逆转mRNA中的m⁶A。与FTO不同，ALKBH5对m⁶Am无活性，这可能与其缺乏类似FTO的结构折叠有关。晶体学与生化研究显示，ALKBH5的活性位点空腔小于FTO，使其对底物筛选更严格，无法容纳较大的修饰碱基，从而排除部分非特异性底物。此外，ALKBH5偏好（A/G）m⁶AC基序的底物序列，而FTO偏好DRACH基序。功能上，ALKBH5直接将m⁶A转化为A而不产生中间体，而FTO催化该过程分为两步。ALKBH5对底物的高选择性可能由其催化口袋中邻近关键HX(D/E)基序的疏水残基所解释，这些残基降低了口袋对N⁶-羟甲基腺苷和N⁶-甲酰基腺苷等中间体亲水基团的亲和力。ALKBH5主要定位于细胞核，而FTO在核质均有分布，表现出不同的去甲基化偏好。

2.3 m⁶A修饰RNA的命运由读取蛋白解码

m⁶A可被m⁶A结合蛋白识别（图1），进而影响mRNA命运。m⁶A结合蛋白主要包括YTHDC家族（YTHDC1/2）、YTHDF家族（YTHDF1/2/3）、HNRNP家族（HNRNPC/G/A2B1）及IGF2BP家族（IGF2BP1/2/3）。其中，YTHDC1在核内促进m⁶A mRNA的剪接与核输出。YTHDC2提高靶标mRNA的翻译效率并降低其丰度。YTHDF1促进m⁶A mRNA的翻译。YTHDF2通过将m⁶A mRNA靶向P小体并招募CCR4-NOT复合物促进其降解；YTHDF3与YTHDF1协同促进m⁶A mRNA翻译，并与YTHDF2协作促进其降解。HNRNPs定位于核内，介导m⁶A mRNA剪接。IGF2BPs保护m⁶A mRNA免受P小体降解并促进mRNA翻译。脆性X智力低下蛋白（FMRP）促进m⁶A修饰mRNA的核输出，其缺失可通过YTHDF2加速此类靶标降解，同时上调YTHDF1靶标转录本的翻译。综上，多项研究清晰揭示了m⁶A调控因子介导RNA代谢的机制，但对细胞在特定条件下精确调控特定同工型及其靶标转录本、以及某些转录本在特定时期被甲基化而其他不被甲基化的原因仍缺乏全面认知，这些共性问题有待充分阐明。

3 m⁶A图谱绘制与定量：新兴工具与技术

理解m⁶A在RNA中的分布对解析生物学过程具有重要意义。研究人员总结了高通量m⁶A检测技术的发展（图2）。3.1 转录组-wide定位。3.1.1 非单碱基分辨率m⁶A图谱。2012年两个独立团队首次报道基于m⁶A抗体的转录组-wide定位方法，称为甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-seq或m⁶A-seq）。该方法分离纯化mRNA后进行片段化，利用抗m⁶A抗体免疫沉淀m⁶A修饰片段再进行测序。作为基础技术，其广泛应用于各类生物样本，但无法精确定位具体位点，且存在抗体与m⁶Am的交叉反应性，需约150 ng poly(A) RNA或500 ng总RNA输入，对稀有或低丰度样本分析构成挑战。光交联辅助m⁶A测序（PA-m⁶A-seq）受PAR-CLIP启发，分辨率提升至约30 nt。该方法将细胞与4-硫尿苷（4SU）孵育，使其在合成期掺入新生RNA。UV诱导4SU标记的RNA与m⁶A抗体发生共价交联，最终在m⁶A附近产生T-to-C转换。然而，该方法需4SU孵育，不适用于组织样本，且性能受孵育期4SU生物转化效率影响，4SU处理可能引发细胞应激反应。相比上述两种方法，m⁶A-SEAL-seq是一种不依赖抗体的方法，利用FTO辅助化学标记检测m⁶A。该方法将化学惰性的m⁶A转化为高活性中间体N⁶-羟甲基腺苷（hm⁶A），随后通过加成与巯基反应实现m⁶A修饰RNA富集，具有处理时间短、成本低及RNA输入要求低的优势。3.1.2 单碱基分辨率m⁶A图谱。为提高m⁶A分布定位精度，研究人员采用多模态策略提升检测准确性，结合抗体、酶学与化学方法。3.1.2.1 抗体基技术。m⁶A-CLIP是与iCLIP类似的方法，片段化RNA与m⁶A抗体孵育后，UV诱导抗体与m⁶A修饰RNA共价交联，导致逆转录期C-to-T转换或截断。但该方法可能因抗体无法区分m⁶A与m⁶Am，或UV优先交联RNA嘧啶碱基而产生假阳性信号，且缺乏区分m⁶A簇的单核苷酸分辨率。MeCLIP通过3’RNA接头连接简化了复杂的[γ-³²P] ATP标记步骤，提高了文库复杂性。另一种基于CLIP的方法m⁶ACE-seq消除了前两种方法的复杂步骤并降低了噪音，但这些抗体基测序策略区分m⁶A与m⁶Am的能力有限。3.1.2.2 酶基技术。MAZTER-seq是一种依赖RNase MazF的转录组-wide m⁶A修饰分析技术。MazF酶特异性识别并在ACA位点基序前切割，但不切割（m⁶A）CA基序。因此对切割后RNA进行逆转录测序可准确预测m⁶A位点并定量m⁶A化学计量。作为另一种MazF依赖方法，m⁶A-REF-seq在MazF介导切割前用FTO去甲基化酶预处理样本，确保m⁶A位点鉴定的可靠性。两种方法均适用于微量样本分析，但受限于针对ACA基序的窄谱酶底物，导致检出的m⁶A修饰位点远低于实际水平（如哺乳动物细胞中仅检出16%）。依赖于脱氨酶的单碱基分辨率测序方法包括DART-seq与eTAM-seq。DART-seq将胞苷脱氨酶APOBEC1与m⁶A结合YTH结构域融合，该融合蛋白特异性识别m⁶A修饰位点并诱导侧翼胞苷脱氨为尿苷，从而实现m⁶A修饰位点定位。虽可从低RNA输入绘制m⁶A位点，但转染效率直接影响脱氨编辑效率并限制应用。eTAM-seq利用大肠杆菌来源的TadA8.20脱氨酶选择性地将未甲基化腺苷脱氨为肌苷，逆转录期被读作鸟苷，实现转录组-wide m⁶A沉积的定位与定量分析，可在超低RNA输入（低至10个细胞的RNA）下实现特定位点定量检测。3.1.2.3 化学反应基技术。除酶介导脱氨外，GLORI通过化学脱氨实现单碱基m⁶A测序。该方法先保护鸟苷，经亚硝酸盐处理后有效将未甲基化腺苷脱氨为肌苷，随后碱性或加热条件下脱保护鸟苷。逆转录期肌苷与胞苷配对并被读作G，而m⁶A抵抗脱氨。该方法重现性好且成本效益高，但苛刻的化学处理会损害RNA完整性，且无法区分其他修饰。相比GLORI，CAM-seq在温和反应条件下操作，最小化RNA降解，可在最低10 ng mRNA输入下实现高灵敏度检测，背景噪音低至0.5%，适用于低丰度转录本分析。S-腺苷甲硫氨酸类似物作为外源甲基供体被用于m⁶A-label-seq。该方法利用细胞摄取硒代烯丙基-L-硒代高半胱氨酸（allyl-SeAM）/S-烯丙基高半胱氨酸（allyl-SAM）代谢标记推定m⁶A位点为N⁶-烯丙基腺苷（a⁶A）。碘化条件下a⁶A环化为N¹,N⁶-环化腺苷（cyc-A），逆转录期cyc-A诱导的错配指示m⁶A位点。相比DART-seq等方法，m⁶A-label-seq检测簇状m⁶A位点灵敏度更高。此外，利用硒基辅底物类似物在m⁶A位点安装炔丙基的策略也被用于绘制mRNA m⁶A甲基化组。这些方法需细胞摄取SAM类似物，因此标记效率与取样时间对m⁶A位点鉴定至关重要，且SAM类似物处理可能引发细胞应激反应。为克服SAM类似物细胞孵育的局限，m⁶A-SAC-seq利用来自詹氏甲烷球菌的二甲基转移酶MjDim1，在烯丙基-SAM存在下选择性将烯丙基转移至m⁶A形成N⁶-烯丙基,N⁶-甲基腺苷（a⁶m⁶A），随后碘处理诱导a⁶m⁶A环化产生突变信号，通过高通量测序分析m⁶A沉积的位置与定量。该方法仅需约30 ng输入RNA，但MjDim1偏好GAC基序而非AAC，可能损害对所有m⁶A位点的标记。此外，还开发了独立于脱氨与SAM模拟标记的化学方法，如涉及4-位硒修饰脱氧胸苷三磷酸（4SedTTP）与FTO辅助的策略，以及m⁶A-ORL-seq。前者利用4SedTTP抑制其与m⁶A的碱基配对，产生特异性逆转录截断信号，以FTO处理的RNA样本作为对照；后者采用选择性化学标记进行单碱基m⁶A检测，可检测低丰度甲基化样本，但存在诱导非靶碱基脱氨及反应效率低导致假阳性的风险。3.2 单细胞与亚型特异性方法。传统群体细胞甲基化测序掩盖了细胞类型特异的动态甲基化变化，阻碍了对不同细胞群间表观转录组异质性的洞察。近期单细胞m⁶A测序技术（如scDART-seq、scm⁶A-seq、sn-m⁶A-CT）的发展开启了解析细胞类型分辨m⁶A修饰及其功能的变革时代。scDART-seq将液滴微流控（10x Genomics）scRNA-seq整合至DART-seq，实现区分细胞亚群的甲基化特征，是首个单细胞水平m⁶A检测方法，可检测单个细胞间m⁶A位点分布与丰度的变异，无需依赖基因表达波动即可区分细胞亚群。但scDART-seq需将APOBEC1-YTH质粒转染入细胞，限制了其在原代细胞及体内实验中的应用。scm⁶A-seq是通过RNA多重标记与MeRIP-seq开发的单细胞m⁶A测序技术，可同时在单细胞水平分析m⁶A甲基化组与转录组。研究人员利用该方法揭示了早期发育两细胞胚胎卵裂球间m⁶A依赖的表观转录组不对称性，并鉴定出多个差异m⁶A修饰的转录因子。PicoMeRIP-seq是另一种不依赖RNA标记的m⁶A抗体依赖单细胞m⁶A定位技术，通过优化样本回收与信噪比，实现了皮克级poly(A) RNA及少至10个细胞的转录组-wide m⁶A测序，揭示了m⁶A调控机制与生育及发育缺陷的关联。sn-m⁶A-CT则用于同时分析数千个单核的转录组与甲基化组，但在分离核中对m⁶A-RNA进行标记，利用二抗与Tn5转座酶结合RNA-抗体复合物，经逆转录与转座获得接头标记的RNA/cDNA杂交体。然而，sn-m⁶A-CT是基于抗体的技术，存在分辨率低、与m⁶Am交叉反应及缺乏单个m⁶A位点的定量化学计量信息等局限。上述大多数方法涉及片段化与潜在降解，损害了亚型表征完整性。检测可变RNA亚型中的m⁶A修饰水平具有重要意义，因其对调控转录本表达至关重要。m⁶A-LAIC-seq被开发用于确定每个基因各转录本间m⁶A修饰水平与位点特异性模式的差异，通过抗m⁶A抗体免疫沉淀全长转录本，再逆转录测序，可检测单个基因甲基化与非甲基化转录本的差异亚型使用，但该方法量化的是亚型水平的m⁶A化学计量而非单个m⁶A位点。总体而言，上述测序方法均需cDNA合成与扩增，可能导致碱基错配与缺失。这一局限推动了RNA修饰直接检测技术的发展。2018年Oxford Nanopore Technologies Ltd开发了纳米孔测序技术，实现直接长读长RNA测序。该技术利用跨膜纳米孔蛋白作为生物传感器，捕获单链DNA/RNA穿过纳米孔时产生的细微离子电流波动。纳米孔测序技术的进步促进了多种RNA修饰的同时检测，计算机信号判别系统持续优化以提高检测效率与准确性，包括基于碱基识别错误率的算法（如DRUMMER、ELIGOS、JACUSA2）及依赖原始离子电流信号的算法（如MINES、xPore、DENA、CHEUI、Nanocompore）。此外，纳米孔直接RNA测序与DART结合可准确定量RNA亚型中的m⁶A修饰及其动态与调控复杂性。作为一种新兴技术，其仍面临诸多挑战，如储存期样本降解（尤其mRNA）及技术准确性需进一步优化。

4 m⁶A在细胞与机体稳态中的生理作用

m⁶A修饰不仅是RNA的结构改变，更是深刻影响广泛生理进程的动态调控机制（图3）。其作用从控制RNA分子的基本命运延伸至调控复杂的机体功能，凸显了其在维持细胞与系统稳态中的重要性。4.1 干细胞自我更新与分化。干细胞是多细胞生物发育、组织再生与生理稳态维持的基础，其独特生物学特性由两个属性定义：一是自我更新能力，即细胞分裂产生的子代保留亲代表型以维持干细胞池；二是多能性，即在特定诱导信号刺激下分化为多种功能谱系的能力。转录因子网络与染色质重塑长期被认为是这些进程的主要调控机制，而表观转录组学的兴起揭示，RNA水平的化学修饰（尤其是m⁶A）是决定干细胞命运的不可或缺“分子开关”（图3A）。m⁶A的动态调控对胚胎干细胞（ESC）的细胞命运转变至关重要。由甲基转移酶METTL3催化的m⁶A修饰调控多能性维持与谱系分化。机制上，HDAC2招募METTL3介导靶基因m⁶A沉积，随后通过IGF2BPs与YTHDC2调控RNA稳定性与翻译。YTHDF2对人胚胎干细胞（hESC）分化（尤其向外胚层分化）很重要，但对多能性维持非必需。证据表明，m⁶A修饰的ROBO1 mRNA是神经外胚层特化期YTHDF2的潜在靶标。此外，m⁶A去甲基化酶ALKBH5缺失严重损害定型内胚层分化，ALKBH5^?/?hESC无法完成原条过渡，该缺陷由GATA6转录本3’UTR的m⁶A高甲基化通过YTHDF2依赖方式使其mRNA不稳定所驱动。在神经发生过程中，神经干细胞（NSC）必须退出细胞周期分化为神经元与神经胶质，或进入静息态以维持成体干细胞储备。YTHDF2通过介导m⁶A依赖的mRNA衰变限制TGF-β信号组分表达，其缺失导致TGF-β信号异常激活，迫使增殖的海马NSC过早退出细胞周期进入深度静息，最终耗竭神经发生能力。近期研究进一步阐明m⁶A在造血干细胞中的作用，METTL3或YTHDF3等调控因子缺失损害自我更新与谱系分化。相反，敲除YTHDF2通过阻止清除维持干性必需的m⁶A修饰转录本，促进造血干细胞扩增与再生。m⁶A修饰精确协调骨髓间充质干细胞（BMSC）的成骨分化。METTL3与WTAP作为BMSC成骨分化的正调控因子，而METTL16抑制该过程。具体而言，METTL16增强PPARγ转录触发铁死亡并抑制成骨分化。而去甲基化酶FTO通过m⁶A-YTHDF1依赖方式降低PPARγ mRNA稳定性促进成骨分化。有趣的是，另一种去甲基化酶ALKBH5通过加速PRMT6 mRNA降解抑制PI3K/AKT信号，作为成