《Cancer Science》：MAPK Inhibitor-Tolerant Persister Cells in Melanoma: Mechanisms and Therapeutic Vulnerabilities
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尽管靶向治疗和免疫治疗的重大进展不断涌现，转移性黑色素瘤因早期药物耐受及最终耐药，仍是最难治愈的恶性肿瘤之一。越来越多的证据表明，药物耐受持留细胞（drug-tolerant persister cells）是MAPK通路抑制下存活的关键非遗传机制。遗传耐药克
尽管靶向治疗和免疫治疗的重大进展不断涌现，转移性黑色素瘤因早期药物耐受及最终耐药，仍是最难治愈的恶性肿瘤之一。越来越多的证据表明，药物耐受持留细胞（drug-tolerant persister cells）是MAPK通路抑制下存活的关键非遗传机制。遗传耐药克隆依赖稳定的基因突变维持增殖，而持留细胞则进入可逆的慢周期状态，由应激条件触发。本综述整合了当前关于黑色素瘤持留细胞形成相关分子与细胞机制的研究，聚焦于表型可塑性、选择性翻译调控、代谢重编程、氧化还原缓冲及代偿性信号通路。研究人员强调了MITF低表达、SOX10低表达及KDM5B高表达状态的动态转换如何使细胞在治疗压力下维持持留；表观转录组调控及向氧化/脂质依赖过程的代谢偏移如何使细胞解耦增殖并聚焦于生存。此外，研究人员探讨了肿瘤微环境驱动的RhoA-FAK-AKT信号及氧化还原适应性硫代谢作为独特的适应性耐药机制。最后，本文指出持留状态是稳定耐药产生的进化中间体，并提出了靶向持留细胞短暂脆弱窗口、预防黑色素瘤获得性耐药的治疗策略。
1 引言
尽管免疫检查点抑制剂可使部分患者获得持久缓解，抗PD-1单药客观缓解率约35%–50%，联合抗CTLA-4与抗PD-1治疗缓解率达58%–67%；BRAF突变型黑色素瘤患者对BRAF与MEK联合抑制剂反应迅速，缓解率为65%–80%，但复发多发生于12–15个月内，凸显MAPK靶向治疗的持久性局限。药物耐受持留细胞是MAPK通路抑制后早期复发的核心驱动因素，可在致死浓度药物中存活，表现为临床缓解后的延迟复发或远处转移。持留细胞的存活依赖非遗传机制，包括表观重塑、选择性mRNA翻译及代谢适应，而非稳定耐药突变。与获得可遗传改变的遗传耐药克隆不同，持留细胞进入可逆的慢周期状态，特征为全局蛋白合成受抑，同时选择性翻译应激适应转录本。该适应性状态具有高度可塑性与异质性，包含KDM5B高表达的慢周期细胞、SOX10低表达的侵袭细胞等多种表型，均受治疗与微环境应激塑造。本综述系统梳理了黑色素瘤持留细胞在MAPK通路抑制下的主要应激适应程序，涵盖表型可塑性、选择性翻译、代谢重编程、氧化还原缓冲及替代生存信号通路激活，这些适应既是持久缓解的核心障碍，也是预防耐药的合理联合策略靶点。
2 遗传与信号基础
约50%的皮肤黑色素瘤存在BRAF V600E激活突变，驱动MEK–ERK信号持续活化，使细胞高度依赖MAPK通路增殖与存活；另有15%–25%的黑色素瘤携带NRAS突变，通过上游RAS激活MAPK通路。尽管上游驱动事件不同，两类肿瘤均以ERK活性持续升高为核心致癌需求。BRAF抑制剂单药治疗虽可产生快速临床缓解，但因负反馈缺失及旁路通路激活导致ERK信号适应性再激活，缓解持续时间短；BRAF与MEK联合抑制虽更有效抑制MAPK信号并延缓复发，但疾病进展仍不可避免，提示非遗传适应机制在早期药物耐受中起关键作用。单细胞研究显示，MAPK通路抑制并未完全抑制所有黑色素瘤细胞的ERK信号，部分细胞在给药后出现短暂的ERK再激活，该现象难以被批量检测捕获，并与治疗下的持留及生长逃逸相关。活体成像进一步支持基质微环境在BRAF抑制早期药物耐受中的作用。机制上，BRAF抑制可阻断主导MAPK信号轴，但通过受体酪氨酸激酶（RTK）驱动的上游信号及RAF二聚体依赖性ERK再激活实现适应性反弹。ERK信号的振幅与持续时间决定细胞命运：过度或持续的ERK激活诱导凋亡，而精确调控的瞬时信号则支持存活。MAPK负反馈的破坏进一步塑造该平衡——BRAF抑制快速耗竭双特异性磷酸酶，使细胞对上游输入超敏，同时更依赖残留缓冲机制避免ERK过度激活毒性。肿瘤微环境的炎症信号也参与塑造适应性微环境：MAPK通路抑制期间，由肿瘤相关巨噬细胞与成纤维细胞构成的黑色素瘤炎症生态位通过细胞因子信号网络促进治疗耐受。
3 表型异质性与可塑性
药物耐受持留细胞与遗传耐药黑色素瘤细胞的区别在于未发生继发性突变，而是依赖表型可塑性——即在药物应激下可逆地在不同转录与代谢状态间转换的能力。转录组分析显示，持留细胞在MAPK通路抑制期间可占据多种不同的存活状态，支持表型异质性而非单一均一的持留群体。小眼畸形相关转录因子（MITF）是黑色素瘤表型可塑性的核心调控因子，协调增殖、分化与侵袭程序。MITF稳态模型提出，MITF表达梯度变化驱动不同表型结局：极低水平与衰老相关，中低水平促进侵袭与迁移行为，中高水平支持增殖并降低侵袭性。MITF低表达状态常与受体酪氨酸激酶（尤其是AXL）激活偶联，MITF与AXL的比值降低在临床前研究中与MAPK通路抑制敏感性下降相关。转谷氨酰胺酶2可调控该轴，其缺失促使细胞向MITF低、AXL高的治疗耐受状态转变。谱系分化的另一端，神经嵴转录因子SOX10缺失定义了另一种持留程序，特征为侵袭性间充质样表型、细胞外基质重塑及黏着斑激酶信号增强。SOX10低表达持留细胞对MAPK通路抑制耐受增强，但该重编程也引入特定脆弱性：凋亡抑制蛋白cIAP2表达降低使其对IAP拮抗剂（如birinapant）选择性敏感，IAP拮抗联合MAPK通路抑制可在临床前模型中延缓复发并延长生存期。第三种持留表型以组蛋白去甲基酶KDM5B高表达为特征，KDM5B高表达黑色素瘤细胞进入慢周期的黑素细胞样状态，表现为胞质分裂受损与可逆的生长停滞，从而在MAPK通路抑制下存活。持续诱导KDM5B可将细胞阻滞于G1期，抑制肿瘤生长并保留治疗敏感性，提示强制稳定特定持留状态可作为治疗策略。综上，黑色素瘤持留细胞处于连续的表型状态谱，而非单一适应终点，MITF低/AXL高、SOX10低、KDM5B高程序在治疗与微环境信号下动态转换，凸显针对特定状态的治疗策略必要性。
4 翻译与表观转录组重编程
翻译重塑是黑色素瘤持留细胞在MAPK通路抑制下存活的核心适应策略。BRAF与MEK抑制剂引发急性代谢与蛋白毒性应激，激活综合应激反应——这一保守通路在抑制全局蛋白合成的同时，选择性翻译应激适应转录本。MAPK通路抑制快速诱导真核起始因子2α（eIF2α）磷酸化，抑制eIF2B活性并广泛降低翻译起始。尽管全局翻译受抑，综合应激反应仍促进支持谱系可塑性与存活的转录本选择性翻译：谷氨酰胺剥夺或eIF2α持续磷酸化条件下，黑色素瘤细胞优先诱导激活转录因子4（ATF4），其抑制MITF转录并上调AXL，驱动去分化、侵袭性及药物耐受的持留表型。遗传学研究表明，eIF2α磷酸化是该适应程序的关键驱动因素，支持综合应激反应激活在黑色素瘤细胞可塑性中的因果作用，而非仅作为药物暴露的被动结果。持留细胞的选择性翻译还受到N6-甲基腺苷（m6A）修饰的表观转录组调控。核糖体测序显示，MAPK抑制剂处理后的黑色素瘤细胞全局蛋白合成显著受抑，但编码表观调控因子及PI3K-mTORC2生存通路的转录本（包括CREBBP、ARID1A、CHD6、RICTOR、PIK3CA）仍高效翻译。这些转录本的5'非翻译区富集m6A修饰，可通过RNA解旋酶eIF4A实现不依赖帽结构的翻译起始。干扰m6A甲基转移酶组分（包括METTL3与WTAP）会损害选择性翻译并恢复对MAPK通路抑制的敏感性，证实m6A依赖性翻译是持留细胞的关键存活机制。与此一致，eIF4A的药理抑制剂silvestrol可通过抑制m6A富集的生存转录本选择性靶向黑色素瘤持留细胞，在临床前模型中减少持留细胞产生并降低已建立的持留群体活力，凸显翻译机器是可靶向的脆弱节点。选择性翻译调控还直接塑造持留细胞的代谢可塑性：RNA加工激酶UHMK1促进编码线粒体与代谢蛋白的mRNA翻译，使MAPK通路抑制期间向氧化磷酸化（OXPHOS）偏移；UHMK1缺失会损害线粒体呼吸、降低持留细胞存活并在体内延缓耐药出现，将翻译重编程与持留所需的代谢适应直接关联。这些发现表明，翻译重塑使黑色素瘤细胞在治疗应激下将存活与增殖解耦，选择性维持应激适应、代谢及生存程序，确立翻译机器在非遗传药物耐受中的核心地位。
5 代谢重编程
5.1 糖酵解抑制与MITF–PGC-1α氧化反弹
黑色素瘤细胞优先依赖有氧糖酵解，该表型由组成性MAPK信号驱动，临床表现为高18F-FDG摄取。ERK依赖的HIF-1α与c-MYC诱导维持该糖酵解状态，BRAF抑制快速抑制这些程序，导致糖酵解通量崩溃。作为响应，部分黑色素瘤细胞发生快速、可逆的代谢转换，转向线粒体氧化磷酸化，这是持留适应的关键特征。ERK活性丧失稳定MITF并增强过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）转录，后者是线粒体生物发生与氧化代谢的主调控因子。PGC-1α上调在MAPK通路抑制后数天内即显著增加耗氧量，符合非遗传代谢适应而非克隆选择的特征。接受BRAF抑制剂（联合或不联合MEK抑制剂）治疗后进展的患者肿瘤活检显示，约半数耐药肿瘤中PGC-1α表达升高，提示PGC-1α驱动的OXPHOS是限制MAPK通路抑制疗效的主要适应程序；但也有耐药黑色素瘤表观抑制PGC-1α并采用其他代谢程序，体现耐药异质性。该代谢反弹可被靶向干预：mTORC1与mTORC2双重抑制促进MITF磷酸化及胞质滞留，抑制PGC-1α表达并瓦解氧化磷酸化。临床前模型中，MEK联合mTORC1/2抑制可选择性再增敏MITF-PGC-1α高表达的肿瘤，对OXPHOS低表达的黑色素瘤影响极小，提示MITF定位与PGC-1α表达可作为筛选适合MEK联合mTORC1/2治疗患者的生物标志物。
5.2 BRAF突变持留细胞的过氧化物酶体脂质代谢
对BRAF/MEK抑制处理的 patient-derived异种移植瘤中分离出的残存持留细胞进行单细胞转录组分析，鉴定出一类具有营养剥夺与脂质依赖特征的持留群体，称为饥饿样黑色素瘤细胞。这些细胞上调脂肪酸转运蛋白CD36并激活脂肪酸氧化（FAO）程序，但其存活特异性依赖酰基辅酶A氧化酶1（ACOX1）介导的过氧化物酶体FAO。CD36诱导快速且可逆，符合代谢可塑性而非克隆选择。遗传或药理抑制ACOX1可选择性损害耗氧、诱导毒性脂质蓄积，并与BRAF和MEK抑制联合产生持久肿瘤控制；单独阻断线粒体FAO无此效应，凸显过氧化物酶体FAO在该持留状态下的非冗余代谢依赖性。除FAO外，过氧化物酶体生物发生本身对CD36阳性持留细胞的存活至关重要：破坏过氧化物酶体组装诱导细胞毒性神经酰胺蓄积，持留细胞通过UDP-葡萄糖神经酰胺葡萄糖基转移酶介导的解毒作用缓冲该效应。联合抑制过氧化物酶体生物发生与神经酰胺清除可选择性根除CD36阳性持留细胞，并在BRAF抑制剂复发异种移植模型中延长肿瘤控制时间。
5.3 NRAS突变持留细胞的ROS偏向性静止
NRAS突变黑色素瘤与BRAF突变疾病属于不同的代谢实体，通过CRAF与PI3K通路信号传导，基线氧化与糖酵解能力较低，这种配置限制了急性应激下的代谢灵活性。短暂营养剥夺期间，NRAS突变细胞通过将信号重路由至NRAS-BRAF以维持糖酵解通量，在葡萄糖受限条件下暴露出对糖酵解抑制的脆弱性。相比之下，慢性MAPK通路抑制驱动一种静止的持留状态，特征是糖酵解与磷酸戊糖通路均受抑制，导致NADPH与谷胱甘肽生成减少，氧化还原缓冲能力受损，对氧化应激高度敏感。因此，NRAS突变持留细胞依赖一种与BRAF突变黑色素瘤中氧化或脂质依赖程序不同的ROS偏向性生存策略，揭示基因型特异性的代谢脆弱性，可用于靶向干预。
6 氧化还原与硫代谢
MAPK通路抑制诱导代谢快速向线粒体呼吸偏移，增加电子传递链活性并产生活性氧（ROS）爆发。BRAF与MEK抑制剂处理后数小时内，黑色素瘤细胞即蓄积超氧化物与过氧化物，触发必须被主动缓冲才能存活的氧化应激。药物耐受持留细胞启动多重部分冗余的氧化还原适应程序，共同限制氧化损伤并维持线粒体功能。一个显著的适应是重编程硫代谢以产生活性硫物种：药物暴露选择性上调胱硫醚γ裂解酶（CSE）并同时抑制胱硫醚β合酶，将胱氨酸重定向为硫化氢与低分子量过硫化物的生成。这些硫物种促进蛋白质过硫化——一种可逆修饰，可保护催化性半胱氨酸残基免于不可逆氧化，同时维持酶活性。此外，硫化氢与过硫化物的氧化支持呼吸链的电子流，在氧化应激下维持ATP生成。体内实验中，抑制CSE可破坏该氧化还原屏障，并与MAPK通路抑制联合延缓耐药发生，确立硫代谢为持留细胞的功能依赖性。持留细胞还启动由ATF4与核因子E2相关因子2（NRF2）驱动的半胱氨酸回补程序：当通过xCT反向转运体的胱氨酸摄入或谷胱甘肽合成受损时，ATF4诱导转硫途径酶以恢复细胞内半胱氨酸池，NRF2则在长期应激期间强化抗氧化防御。该程序不仅维持氧化还原平衡，还影响黑色素瘤谱系状态——半胱氨酸衍生代谢物支持MITF启动子处的组蛋白乙酰化并维持分化程序。破坏xCT可降低MITF表达、损害溶酶体生物发生，并使黑色素瘤细胞对脂质过氧化与铁死亡敏感。铁死亡诱导剂（如erastin）对BRAF抑制剂耐药的黑色素瘤细胞仍有细胞毒性，可选择性清除药物耐受群体。核因子κB（NF-κB）信号为持留细胞提供另一层氧化还原缓冲：治疗诱导的ROS激活NF-κB依赖性转录程序，包括诱导线粒体超氧化物歧化酶2，将超氧化物转化为过氧化氢以供下游解毒。NF-κB驱动的抗氧化信号支持持续氧化应激下的存活，并与侵袭性、去分化的黑色素瘤细胞状态交叉，强化氧化还原控制与表型可塑性的关联。最后，持留细胞通过调控丙酮酸脱氢酶复合体对氧化代谢施加代谢制动：氧化应激激活丙酮酸脱氢酶激酶，导致PDH E1α亚基磷酸化，减少丙酮酸进入三羧酸循环的通量，从而限制进一步的线粒体ROS生成并维持存活。药理抑制PDK活性可逆转该适应，增加线粒体ROS并使黑色素瘤细胞对MAPK通路抑制增敏，凸显PDH-PDK轴是破坏持留细胞氧化还原稳态的补充靶点。这些分层的氧化还原缓冲程序使黑色素瘤持留细胞能够耐受治疗诱导的氧化应激，同时维持代谢功能，每个通路虽机制不同，但均收敛于限制ROS介导的损伤，揭示多个潜在可协同靶向的脆弱点。
7 代偿性RhoA-FAK-AKT信号
7.1 FAK是微环境驱动耐药的核心节点
在BRAF V600E突变黑色素瘤中，MAPK通路抑制的非遗传耐药深受肿瘤微环境影响。活体成像研究显示，BRAF抑制剂给药后ERK信号虽被快速抑制，但在黑色素瘤相关成纤维细胞富集区域，部分黑色素瘤细胞发生早期通路再激活；而在低基质密度区域，细胞维持持续的ERK抑制。机制上，BRAF抑制刺激成纤维细胞介导的细胞外基质重塑，包括纤连蛋白沉积增加；纤连蛋白与整合素β1结合促进黏着斑组装，激活黏着斑激酶（FAK）与Src信号，使细胞在持续MAPK通路抑制下仍能适应性再激活ERK。FAK单独抑制对未用药黑色素瘤细胞影响极小，但联合抑制FAK与BRAF可阻止ERK再激活并诱导黑色素瘤-成纤维细胞共培养系统中的细胞死亡，凸显黏着斑信号的情境依赖性作用。治疗后黑色素瘤活检的转录组分析进一步支持黏着斑信号作为代偿通路，黏着斑基因集在耐药肿瘤中持续富集；RAF与MEK抑制剂处理可增加FAK磷酸化，表明该通路在药物压力下被适应性激活。FAK上游的Rho家族GTP酶调控肌动蛋白细胞骨架动力学与黏着斑组装：BRAFi耐药黑色素瘤细胞常表现出肌动蛋白聚合增强与RhoA活性升高，配对肿瘤分析显示相当比例的耐药病例中存在RhoA或RhoC信号增强。尽管直接靶向RhoA具有挑战性，抑制下游Rho相关激酶可破坏肌动蛋白应力纤维，并选择性增敏RhoA高表达的耐药黑色素瘤细胞，为该适应性通路提供了可及的干预切入点。FAK位于RhoA下游、AKT激活上游：抑制RhoA信号减弱FAK磷酸化及下游AKT信号，而强制激活AKT可绕过FAK抑制，在MAPK通路抑制下维持存活；体内实验中，FAK抑制可下调AKT激活并增强对MAPK通路抑制剂的敏感性，而组成性AKT信号即使在FAK靶向治疗中仍可介导耐药。
7.2 核FAK介导的凋亡抑制
除胞质信号功能外，FAK还通过独特的核机制促进黑色素瘤持留细胞存活。抑制FAK诱导凋亡的效果优于阻断PDK1、AKT或SRC等下游效应分子，凸显其在非遗传耐药中的核心调控节点地位。治疗应激下，FAK转位至细胞核，直接与野生型p53结合并抑制其转录活性，阻止BAK、BAX、PUMA等促凋亡靶基因的诱导，促进凋亡抵抗状态以支持持留细胞存活。遗传学敲低或药理抑制FAK可恢复p53活性，逆转侵袭性表型转换，并使黑色素瘤细胞重新对凋亡刺激敏感。这些发现确立FAK是黑色素瘤持留细胞非遗传耐药的核心整合者：通过胞质RhoA-FAK-AKT轴的激活，FAK使细胞适应微环境信号并在MAPK通路抑制下维持存活；同时，核FAK抑制p53依赖性凋亡，提供独立于生长因子的额外保护。通过桥接细胞外基质感知、细胞骨架重塑与内在凋亡抵抗，FAK在代偿性生存通路中占据独特位置，是针对黑色素瘤持留细胞的联合策略的重要靶点。
8 持留向耐药的演化
尽管遗传耐药黑色素瘤细胞与药物耐受持留细胞表型不同，但越来越多的证据表明，耐药常源于持续MAPK通路抑制下的持留群体。患者来源异种移植模型的时空分析支持一个可重复的轨迹：黑色素瘤细胞从增殖性、糖酵解状态，转换为以代谢重编程与侵袭性为特征的慢周期持留细胞，随后重新出现具有不同分子特征的增殖性耐药群体。因此，持留细胞是关键进化储备，而非治疗的短暂副产物。靶向持留亚群（如依赖FAK-AKT信号的神经嵴干细胞样状态）可在临床前模型中延缓复发并延长无进展生存期。值得注意的是，抑制非遗传持留程序最终迫使肿瘤走向遗传固定的耐药机制，包括MAPK通路再激活。这些发现将持留细胞定位为耐药演化的门户，强调早期干预以限制靶向治疗下适应轨迹的重要性。上述适应程序揭示了多个候选治疗脆弱点，包括靶向MAPK再激活、表型可塑性、翻译重编程、代谢重编程、氧化还原/硫代谢及微环境机械转导等不同类别的具体干预靶点。
9 局限性与未来方向
尽管取得上述进展，仍存在若干重要局限。当前对黑色素瘤持留细胞生物学的大部分认知来自体外系统与小鼠或异种移植模型，临床患者样本验证相对有限，这源于持留细胞在疾病缓解后难以被发现与分离。因此，持留状态在人类肿瘤中的发生时间、流行程度、空间分布及可逆性仍未完全明确。临床转化的关键挑战在于确定持留状态何时出现、如何在患者样本中可靠识别，以及哪些适应依赖性在特定肿瘤中占主导。目前尚不清楚不同持留程序在同一病灶中共存的频率、这些程序是否在黑色素瘤亚型间保守，以及哪些生物标志物最适合指导个体化治疗策略。解决这些问题需要纵向患者采样、单细胞与空间组学分析，以及更忠实模拟治疗下残存疾病的临床相关模型系统。
10 结论
药物耐受持留细胞是黑色素瘤持久治疗应答的主要障碍。这些细胞并非源于固定遗传改变，而是通过非遗传适应程序在MAPK通路抑制下存活。如本综述所述，持留细胞构成异质性、动态的状态谱，以表型可塑性为共同特征，允许对致死性治疗的短暂耐受，同时保留重新增敏或进展为稳定耐药的能力。该框架解释了为何单纯抑制MAPK信号未能带来持续临床获益：持留细胞存活由将活力与增殖解耦的适应程序支持，包括综合应激反应介导的选择性翻译、向线粒体或过氧化物酶体脂肪酸氧化的代谢重编程、硫基氧化还原缓冲及代偿性RhoA-FAK-AKT信号。这些通路在MAPK通路有效抑制下仍持续存在，并提供肿瘤维持的替代途径。因此，有效的治疗策略需超越癌基因中心的方法，转而靶向维持持留细胞存活的应激适应状态。在耐药变为遗传固定之前，利用这些短暂脆弱窗口的合理联合疗法，可能为更持久的疾病控制提供路径。临床转化的关键挑战在于明确持留状态的发生时机、可靠识别方法，以及特定肿瘤内的主导依赖性，尤其考虑到当前对持留生物学的认知主要来自接受MAPK通路抑制的BRAF突变皮肤黑色素瘤。类似的适应程序是否在其他黑色素瘤亚型（如肢端与黏膜黑色素瘤）中发挥作用，仍是重要的未解问题。
