《Cell Proliferation》：Oxidative Stress Drives Cell Cycle Stalling, Apoptosis and Metabolic Suppression in Cystatin B Deficient EPM1 Patient iPSCs
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胱抑素 B（Cystatin B, CSTB）是半胱氨酸蛋白酶（特别是组织蛋白酶）的抑制剂。CSTB 基因的双等位基因功能丧失突变是导致进行性肌阵挛性癫痫 1 型（EPM1）的原因，这是一种以刺激敏感性肌阵挛和全面性强直 - 阵挛发作特征为的神经退行性疾病。该
胱抑素 B（Cystatin B, CSTB）是半胱氨酸蛋白酶（特别是组织蛋白酶）的抑制剂。CSTB 基因的双等位基因功能丧失突变是导致进行性肌阵挛性癫痫 1 型（EPM1）的原因，这是一种以刺激敏感性肌阵挛和全面性强直 - 阵挛发作特征为的神经退行性疾病。该疾病进展的潜在发病机制包括蛋白质稳态紊乱、氧化应激增加、神经炎症以及神经元凋亡增加。CSTB 的下调也可导致细胞周期缺陷和细胞增殖减少。相反，据报道 CSTB 的过度表达会驱动癌细胞的增殖和存活，这强调了 CSTB 在细胞生长和存活中的重要作用。在当前的研究中，研究人员聚焦于 CSTB 在调节 EPM1 患者干细胞增殖和存活中的作用。研究人员将 EPM1 患者的成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞（iPSCs），这是一种高度增殖的细胞类型。患者细胞表现出生长不良和凋亡增加。此外，EPM1 细胞显示出氧化应激、溶酶体活性增加、DNA 损伤增加和代谢抑制。抗氧化剂处理挽救了生长表型并激活了代谢，表明氧化应激是诱因，而代谢抑制是一种保护性反应。这些数据加强了 CSTB 在支持细胞存活和生长中的核心作用。阐明 CSTB 表达对细胞生长的调控作用，可以促进研究人员对 EPM1 和癌症潜在病理生理机制的理解，并可能为新治疗策略的开发提供信息。
**氧化应激驱动 EPM1 患者 iPSCs 病理机制的研究解读**
进行性肌阵挛性癫痫 1 型（EPM1），又称 Unverricht–Lundborg 病，是一种罕见的神经退行性疾病，主要由胱抑素 B（CSTB）基因的双等位基因功能丧失突变引起。尽管已知 CSTB 作为半胱氨酸蛋白酶（特别是组织蛋白酶）的抑制剂，在维持蛋白质稳态中发挥关键作用，且其缺失与神经炎症及神经元凋亡相关，但 CSTB 在调控细胞周期、增殖及线粒体功能等方面的具体分子机制尚未完全阐明。特别是在 EPM1 的病理进程中，CSTB 缺失如何导致细胞生长受阻及其与氧化应激、代谢改变之间的因果关系仍需深入探究。鉴于 CSTB 在癌症中表现出的促增殖作用与其在 EPM1 中的致病表型形成鲜明对比，利用高增殖特性的细胞模型解析其调控网络显得尤为重要。本研究旨在通过构建 EPM1 患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）模型，系统阐释 CSTB 缺失对细胞存活、增殖及代谢的影响及其潜在机制。
研究人员利用来自三位严重 EPM1 型患者的皮肤成纤维细胞，通过 Sendai 病毒重编程技术生成了诱导多能干细胞（iPSCs）。患者群体包括纯合子十二聚体重复扩增突变携带者及复合杂合子（重复扩增伴有点突变）携带者。研究采用了多种关键技术方法：首先，通过基因组 PCR 和 Sanger 测序验证了 CSTB 基因突变类型及表达水平；其次，利用流式细胞术检测细胞周期分布、凋亡率（Annexin V 染色）、活性氧（ROS）水平（CellROX 及 MitoSOX 探针）以及线粒体含量；再次，通过 Seahorse XF-96 分析仪实时监测细胞的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）以评估线粒体呼吸和糖酵解功能；此外，结合 Western Blot 和免疫荧光技术分析了 DNA 损伤标志物（γ-H2A.X）、关键信号通路蛋白（如 ERK, AKT, mTOR）的磷酸化状态及组织蛋白酶活性；最后，通过使用抗氧化剂 N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）和组织蛋白酶 B 抑制剂进行干预实验，以验证氧化应激在病理表型中的核心驱动作用。
**研究结果总结**
**CSTB 表达在患者 iPSCs 中显著下调**
研究人员通过定量 PCR 和 Western Blot 分析发现，相较于对照组，EPM1 患者 iPSCs 中的 CSTB mRNA 和蛋白表达水平均显著降低。这一结果在通过 shRNA 沉默 CSTB 的对照细胞系中得到重现，而在患者细胞中过表达 CSTB 则显著恢复了其表达水平，证实了细胞模型的有效性。
**CSTB 缺失导致细胞增殖受阻、细胞周期停滞及凋亡增加**
增殖实验显示，患者 iPSCs 的生长速度显著低于对照组。细胞周期分析表明，患者细胞中处于 S 期（DNA 合成期）的细胞比例显著减少，G1 和 G2 期出现停滞，且关键细胞周期调控基因（CDK1, CDK2, CYCLIN D1, CDC25A）表达下调。同时，患者细胞中γ-H2A.X 焦点数量急剧增加，提示 DNA 双链断裂严重，伴随 ERK 信号通路的激活，表明 DNA 损伤反应（DDR）导致了细胞周期阻滞。此外，流式细胞术检测显示患者细胞凋亡率显著升高。
**低水平 CSTB 导致代谢抑制**
Seahorse 代谢分析显示，患者 iPSCs 的基础呼吸、ATP 生成相关呼吸及最大呼吸能力均大幅下降，且糖酵解水平也未见代偿性升高，反而显著降低。线粒体内容物分析表明，患者细胞中活性线粒体数量减少，氧化磷酸化复合物 I 和 V 的蛋白丰度降低。机制上，虽然 AKT 的相对磷酸化水平未变，但其总蛋白量及 mTOR 的磷酸化水平显著降低，提示 AKT/mTOR 信号通路的整体活性受抑可能是导致代谢低下的原因。
**溶酶体活性增强与非线粒体来源的氧化应激**
研究发现患者细胞中组织蛋白酶 B 的活性及整体溶酶体活性显著升高。活性氧（ROS）检测显示，患者细胞质内的 ROS 水平显著增加，但线粒体超氧化物水平未见异常，提示 ROS 主要源自非线粒体途径。使用组织蛋白酶 B 抑制剂处理可特异性降低患者细胞的 ROS 水平，暗示功能亢进的溶酶体可能是氧化应激的主要来源。
**抗氧化治疗可挽救细胞表型**
使用抗氧化剂 NAC 处理患者 iPSCs 后，细胞生长速度显著恢复，凋亡率降低，MTT 信号增强。同时，NAC 处理显著提高了 AKT 和 mTOR 的磷酸化水平，激活了受抑的代谢通路。这表明氧化应激是导致细胞生长缺陷和代谢抑制的上游驱动因素，而代谢抑制可能是细胞应对高氧化应激的一种保护性反应。
**讨论与结论**
本研究证实，CSTB 的缺失通过破坏蛋白质稳态，导致溶酶体组织蛋白酶活性异常升高，进而引发非线粒体来源的氧化应激。这种高水平的氧化应激导致了严重的 DNA 损伤，触发 DNA 损伤反应，致使细胞周期停滞和凋亡增加。同时，氧化应激抑制了 AKT/mTOR 信号通路，导致细胞代谢全面下调，这被推测为一种减少 ROS 产生的保护性机制。研究结果不仅阐明了 CSTB 在维持细胞增殖和存活中的核心作用，还将氧化应激确立为 EPM1 病理机制中的关键驱动因素。这一发现为理解 EPM1 的神经退行性病变提供了新的视角，并支持了抗氧化疗法作为潜在治疗策略的理论基础，尽管其在神经元模型中的具体效应仍需进一步验证。此外，CSTB 在癌症与神经退行性疾病中表现出的双重角色（促增殖与抑增殖），也突显了其在不同病理背景下调控细胞命运的复杂性。
