《Environmental Microbiology Reports》：High Resistance and Biofilm Tolerance to Antimicrobials of Marine Bacteria From Brazilian Deep-Sea Sediment
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抗菌素耐药性研究主要集中于临床细菌，而忽视了自然环境中有抗性分离株的作用。然而，海洋每日都受到来自农业工业和城市活动的大量抗菌药物和耐药细菌的污染。深海沉积物是一个充满挑战的环境，可能筛选出具有化学药剂抗性及生物膜形成能力的微生物菌株，从而成为耐药基因的潜在储
抗菌素耐药性研究主要集中于临床细菌，而忽视了自然环境中有抗性分离株的作用。然而，海洋每日都受到来自农业工业和城市活动的大量抗菌药物和耐药细菌的污染。深海沉积物是一个充满挑战的环境，可能筛选出具有化学药剂抗性及生物膜形成能力的微生物菌株，从而成为耐药基因的潜在储存库。研究人员通过纸片扩散法和微量肉汤稀释法，评估了采自巴西佩洛塔斯盆地（Pelotas Basin）深海沉积物的六株假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、五株芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、两株短芽孢杆菌属（Brevibacillus sp.）和两株类芽孢杆菌属（Paenibacillus sp.）对抗微生物药物的敏感性。分别对假单胞菌属和芽孢杆菌目（Bacillales）测试了 11 种和 7 种抗菌药物。将易感分离株形成的生物膜暴露于抗菌药物下，以测定最小生物膜抑制浓度（MBIC）和最小生物膜清除浓度（MBEC）。所有假单胞菌属菌株均对高浓度（高达 2048 μg/mL）的氨曲南（aztreonam）表现出耐药性。MBIC 值显著高于各自的最低抑菌浓度（MIC），且仅有三分之一的生物膜被清除。这些结果强调了本研究的重要性，因为这是首批报道深海沉积物中可培养细菌生物膜对抗微生物药物耐受性的研究之一，有助于增进对这些环境中细菌耐药性的认识，并关乎同一健康（One Health）议题。
**深海极端环境下的微生物耐药性与生物膜耐受性研究解读**
**研究背景与意义**
海洋覆盖了地球表面超过 70% 的面积，蕴藏着丰富的微生物资源，在维持全球生态系统平衡中发挥关键作用。然而，人类活动导致的污染物排放，特别是抗菌药物的滥用，使得海洋环境面临严峻挑战。尽管抗菌素耐药性（AMR）已被视为全球公共卫生危机，但现有研究多局限于临床来源的微生物，对自然环境中尤其是深海极端环境下微生物的耐药性关注不足。深海沉积物具有高静水压、低氧及气体剧烈流动等特征，是筛选耐化学药剂及具生物膜形成能力菌株的独特场所，可能作为耐药基因（ARG）的长期储存库。随着洋流和生物泵过程，深海与表层海水相连，使得深海成为有机颗粒污染物和微生物的最终汇。因此，探究深海细菌的 AMR 及其生物膜耐受性，对于理解耐药基因在自然环境中的演化、传播及其对人类健康和生态系统的潜在风险具有重要意义，这也符合“同一健康（One Health）”的理念。本研究旨在剖析采自巴西南海岸甲烷渗漏区深海沉积物的可培养细菌（假单胞菌属、芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属）的 AMR 特征及生物膜特异性耐受性。
**技术方法概述**
研究人员从巴西南部大西洋佩洛塔斯盆地里奥格兰德锥（Rio Grande Cone）甲烷渗漏区的深海沉积物（水深 1800 至 2500 米，沉积物深度 0-3 米）中筛选出 15 株细菌，包括 6 株假单胞菌属（Pseudomonas sp.）和 9 株芽孢杆菌目（Bacillales，含芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属和类芽孢杆菌属）。研究采用纸片扩散法和微量肉汤稀释法测定浮游状态下的抗菌药物敏感性，依据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）和临床与实验室标准协会（CLSI）标准，但在 25°C 下培养以适应海洋菌株生长。利用结晶紫染色法评估生物膜形成能力。针对浮游状态下敏感的菌株，进一步测定其预形成生物膜的最小生物膜抑制浓度（MBIC）和最小生物膜清除浓度（MBEC），并通过菌落计数法（CFU/mL）量化未被清除生物膜的存活率。
**研究结果分析**
**AMR 概况**
药敏试验显示，8 株分离菌对至少一种抗菌药物表现出耐药性。所有 6 株假单胞菌属菌株均对氨曲南（aztreonam）表现出高度耐药，最低抑菌浓度（MIC）高达 2048 μg/mL 以上，其中一株还对头孢他啶耐药。两株类芽孢杆菌属（Paenibacillus sp.）分别对克林霉素或同时克林霉素和红霉素耐药。其余芽孢杆菌目菌株对测试药物均敏感。这表明深海假单胞菌属可能存在特定的耐药机制，如外排泵过表达或与金属耐药基因的共选择。
**生物膜形成能力**
15 株菌的生物膜形成能力存在差异：6 株不形成，2 株弱形成，4 株中等形成，3 株强形成。分类学上存在差异，假单胞菌属主要表现不形成至中等形成，而芽孢杆菌目中包含了所有强形成菌株（3 株芽孢杆菌属）。值得注意的是，生物膜形成的强度与随后的抗菌药物耐受性之间未发现直接相关性。
**生物膜条件下的抗菌药物敏感性**
在生物膜状态下，细菌表现出显著的耐受性增强。绝大多数菌株（93.3%）的最小生物膜抑制浓度（MBIC）显著高于其浮游状态的 MIC 值。特别是环丙沙星，对超过三分之二的生物膜即使在最高测试浓度下也无法抑制。在清除实验中，仅三分之一（10/30）的生物膜被成功清除。对于假单胞菌属，妥布霉素在最高浓度下仅能清除一株生物膜，而环丙沙星完全无效；对于芽孢杆菌目，环丙沙星的清除效果优于万古霉素。部分类芽孢杆菌属生物膜在药物处理后存活菌数与未处理组无显著差异，显示出极高的特异性耐受。
**结论与讨论**
本研究证实了深海沉积物细菌不仅具有对特定抗菌药物（如氨曲南）的高水平耐药性，且在生物膜状态下对多种抗菌药物（包括氟喹诺酮类、氨基糖苷类和糖肽类）表现出极强的耐受性。这种耐受性可能与生物膜胞外基质的保护作用及深海极端环境的适应性进化有关。尽管部分菌株在浮游状态下敏感，但在生物膜模式下极难清除，且结晶紫染色法评估的生物膜强度与耐药表型不完全一致。研究结果表明，深海环境可能是耐药基因的重要演化库和储存库。这些耐药基因可能通过水平基因转移或海洋食物网进入人类活动圈，对全球健康构成潜在威胁。该发现强调了将 AMR 研究视野扩展至临床以外自然环境的重要性，为评估海洋微生物资源的风险及制定“同一健康”策略提供了关键的基础数据。
