巨噬细胞 - 成纤维细胞串扰塑造体外伤口修复信号传导

《The FASEB Journal》：Macrophage-Fibroblast Crosstalk Shapes Wound Repair Signaling In Vitro

　　

伤口愈合需要巨噬细胞与成纤维细胞之间的协调相互作用，然而接触依赖性信号传导如何与旁分泌途径整合以调节其相互行为尚不明确。本研究利用互补的二维 (2D) 和三维 (3D) 体外伤口愈合模型，结合活细胞钙离子 (Ca²⁺) 成像和单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 技术，调查了巨噬细胞与成纤维细胞之间的通讯机制。研究结果表明，骨髓来源的巨噬细胞 (BMDMs) 以独立于连接蛋白 (connexins) 的接触依赖方式促进成纤维细胞的划痕闭合；相反，成纤维细胞通过不同的机制反向调节巨噬细胞的细胞因子分泌。具体而言，与成纤维细胞的直接细胞间接触通过缝隙连接蛋白 43 (Cx43) 依赖性信号传导增强了巨噬细胞白细胞介素 -10 (IL10) 的产生，而肿瘤坏死因子α (TNFα) 的分泌则通过旁分泌相互作用受到抑制。研究进一步证明，成纤维细胞与巨噬细胞的接触仅在巨噬细胞中诱导了依赖连接蛋白的间歇性钙信号。scRNA-seq 分析揭示，创伤重塑了巨噬细胞和成纤维细胞群体，发现了细胞粘附分子 (CAMs) 和细胞间信号通路的动态调节。综上所述，这些发现揭示了接触依赖性的钙信号和连接蛋白信号传导与转录重构的整合，从而在愈合过程中协调巨噬细胞 - 成纤维细胞的行为。

伤口愈合是机体应对组织损伤、恢复稳态的关键生理过程，其中巨噬细胞和成纤维细胞作为核心效应细胞，通过复杂的相互作用驱动炎症消退、组织收缩及细胞外基质 (ECM) 的重建。尽管既往研究已明确两者通过旁分泌信号（如细胞因子和趋化因子）进行通讯，且已知它们在创面频繁发生直接接触，但接触依赖性信号如何与旁分泌途径协同整合，进而精细调控双方的互惠行为，目前尚无定论。特别是细胞粘附分子 (CAMs) 介导的物理接触如何转化为特定的细胞内信号（如钙离子波动），以及这些信号如何协调双向的细胞反应，仍是亟待阐明的科学问题。深入理解这一机制，对于揭示慢性伤口或纤维化等愈合障碍的病理基础具有重要意义。

在此背景下，研究人员利用 2D 和 3D 体外伤口愈合模型，结合遗传编码的钙离子指示剂活细胞成像及单细胞转录组学技术，系统解析了巨噬细胞与成纤维细胞间的串扰机制。研究发现，骨髓来源的巨噬细胞 (BMDMs) 能通过非连接蛋白依赖的接触机制显著促进成纤维细胞的迁移与划痕闭合；反之，成纤维细胞则通过接触依赖和非接触依赖的双重机制重塑巨噬细胞的表型：直接接触通过缝隙连接蛋白 43 (Cx43) 介导的信号通路特异性上调抗炎因子 IL10 的分泌，而旁分泌途径则主要抑制促炎因子 TNFα的释放。此外，研究首次证实这种细胞间接触能特异性诱导巨噬细胞产生依赖连接蛋白的间歇性钙振荡。单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 进一步揭示了创伤微环境下细胞亚群的重塑及细胞间通讯网络的重构。该研究成果发表于《The FASEB Journal 》，为理解免疫细胞与基质细胞在组织修复中的协同机制提供了新的分子视角。

为开展此项研究，研究人员采用了多项关键技术手段。首先，利用基因工程小鼠（Salsa6f^fl/flLysMCre^+/?）获得特异性表达钙离子报告蛋白 Salsa6f 的巨噬细胞，结合共聚焦显微镜进行高时空分辨率的活细胞钙成像，以捕捉瞬时的钙信号动态。其次，构建了包含直接接触（共培养）与非接触（Transwell 小室）模式的 2D 及 3D 胶原凝胶伤口模型，模拟体内复杂的微环境。再次，应用磁珠分选技术纯化共培养体系中的不同细胞群，结合 qPCR 检测特定基因表达变化。最后，利用单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 技术对创伤前后的细胞群体进行全转录组分析，并通过 CellChat 等生物信息学工具重构细胞间通讯网络。实验样本主要来源于 C57BL/J6 小鼠的骨髓细胞及 NIH/3T3 成纤维细胞系。

研究结果主要包含以下几个方面：
双向互作调节划痕闭合与细胞因子分泌：研究人员发现，巨噬细胞以促进成纤维细胞划痕闭合，且这种促进作用严格依赖于细胞间的直接接触及足够的细胞密度比例，而与连接蛋白无关。相反，成纤维细胞通过接触依赖机制增强巨噬细胞抗炎因子 IL10 的分泌，同时通过可溶性因子（旁分泌）抑制促炎因子 TNFα的释放，表明两者通过不同模式精确调控炎症反应。

连接蛋白信号调控细胞因子与钙活性：机制研究表明，共培养显著上调了巨噬细胞中的 Cx43 表达。使用连接蛋白解偶联剂棕榈油酸 (PA) 处理或特异性敲低 Cx43，均能阻断共培养诱导的 IL10 分泌增加，但不影响 TNFα水平。钙成像数据显示，成纤维细胞的接触仅在巨噬细胞中诱发了依赖连接蛋白的间歇性钙信号，提示 Cx43 可能作为半通道介导了自分泌钙信号回路，进而调控 IL10 的产生。

3D 环境验证与转录组重塑：在 3D 胶原凝胶模型中，研究复现了 2D 体系中的关键发现，即共培养增强伤口闭合并调节细胞因子分泌。scRNA-seq 分析进一步揭示，创伤刺激导致巨噬细胞和成纤维细胞亚群比例发生显著变化，特定亚群（如 F11 成纤维细胞和 M5 巨噬细胞）丰度增加。转录组分析显示，创伤重塑了细胞粘附分子（如整合素和连接蛋白）及细胞间信号通路的表达谱。

细胞间通讯网络重构：基于 scRNA-seq 数据的细胞间通讯分析表明，成纤维细胞（特别是 F11 亚群）是主要的信号发送者，通过 VCAM、CHEMERIN 等通路向巨噬细胞发送信号，而巨噬细胞则通过 PROS 和 IL10 通路反向调节成纤维细胞。创伤事件显著改变了这些信号通路的强度，揭示了伤口微环境中复杂的分子对话网络。

讨论部分总结指出，本研究阐明了巨噬细胞与成纤维细胞在伤口修复中通过接触依赖和旁分泌两种模式进行双向调控的机制。接触依赖性信号主要通过 Cx43 介导的钙信号通路促进巨噬细胞的抗炎极化（IL10 分泌），而旁分泌信号则主要负责抑制促炎反应（TNFα）。研究强调了物理接触在免疫 - 基质对话中的关键作用，并指出成纤维细胞在创伤后通过重塑粘附分子和信号网络，主动引导巨噬细胞的行为。尽管体外模型存在局限性，但该研究为理解伤口愈合中的细胞互作提供了精细的分子图谱，提示针对特定连接蛋白或钙信号通路的干预可能成为促进组织修复的新策略。

研究结论部分翻译如下：这些发现揭示了接触依赖性的钙信号和连接蛋白信号传导与转录重构的整合，从而在愈合过程中协调巨噬细胞 - 成纤维细胞的行为。成纤维细胞与巨噬细胞之间的细胞间通讯对于伤口愈合至关重要。巨噬细胞通过独立于连接蛋白的接触依赖机制促进成纤维细胞划痕闭合。相比之下，成纤维细胞通过 Cx43 介导的接触信号（增加 IL10）和旁分泌途径（抑制 TNFα）来调节巨噬细胞的细胞因子分泌。钙成像揭示了仅在巨噬细胞中存在的接触诱导的、依赖连接蛋白的 Ca²⁺信号，而转录组分析确定了粘附分子和细胞间信号网络中与伤口相关的变化。