死细胞识别偶联Fcγ受体增强抗肿瘤免疫

《Nature Cancer》：Coupling dead cell recognition to Fcγ receptors augments anticancer immunity

　　

传统树突状细胞1型（cDC1s）是诱导细胞毒性CD8? T淋巴细胞（CTLs）以及多种小鼠肿瘤中免疫检查点阻滞（ICB）疗效的关键抗原呈递细胞（APCs）。在人类中，肿瘤内cDC1s的丰度与CTL浸润及癌症患者良好预后相关。cDC1s的关键特性在于其能够获取并交叉呈递肿瘤细胞相关抗原于主要组织相容性复合体I类分子（MHC-I）上，以启动肿瘤特异性CTLs。肿瘤抗原的重要来源之一是癌细胞自发死亡或治疗诱导死亡后产生的细胞碎片。与其他APCs（包括cDC2s）相比，cDC1s擅长内化这些死细胞残余物，并高表达DNGR-1（又称CLEC9A），一种结合死亡细胞碎片暴露的F-肌动蛋白（F-actin）的C型凝集素受体（CLR）。DNGR-1被F-actin触发后通过脾酪氨酸激酶（SYK）信号促进局部膜去稳定化，可导致随后的吞噬体破裂。通过这种方式，死细胞来源的抗原可释放至胞质（即吞噬体至胞质的转运，P2C），进入内源性MHC-I呈递途径。值得注意的是，在表达SYK的异源细胞中强制表达DNGR-1可赋予这些细胞交叉呈递死细胞相关抗原的能力。这表明cDC1s特化的交叉呈递能力部分源于cDC1特异性受体的信号传导，该受体将坏死细胞检测与SYK通路连接以诱导P2C。

肿瘤中cDC1s的稀缺性限制了抗肿瘤免疫，目前正在进行增加cDC1s数量的治疗策略研究。促使其他数量更多的肿瘤内APCs交叉呈递死癌细胞相关抗原可能是一种替代策略。激活型Fcγ受体（FcγRs）可广泛表达于APCs，通过SYK信号传导，已被报道可激活髓系细胞并促进IgG结合货物的交叉呈递（XP）。研究人员假设，将死细胞识别与FcγR信号偶联可赋予多种非cDC1 APCs取样和交叉呈递死肿瘤细胞抗原的能力，使其激活并重塑肿瘤微环境（TME），从而整体增强抗肿瘤免疫。

研究人员发现，人类泛癌髓系细胞图谱分析显示，cDC1s在多种癌症中被cDC2s远远超出，且cDC2s又被经典单核细胞超越。小鼠MCA205可移植肿瘤模型中同样如此，CD88?单核细胞来源细胞（MCs）和CD172a? cDC2s在CD11c?MHC-II? APCs中 vastly 超过XCR1? cDC1s。转录谱分析显示人类cDC2s和经典单核细胞表达FcγRs（尤其是激活型FcγRIIA和抑制型FcγRIIB），而cDC1s通常缺乏FcγR表达。小鼠肿瘤微环境中，CD88? MCs和cDC2s高表达激活型FcγRI和FcγRIV以及抑制型FcγRIIB，且这些FcγRs具有功能，可介导卵清蛋白免疫复合物（ICs）的摄取，肿瘤来源的CD11c?MHC-II?CD88? MCs可有效交叉呈递OVA-IC至CD8? T细胞。

基于这些发现，研究人员设计了六种Fc-CLR融合蛋白，将小鼠IgG2a Fc与不同CLR的胞外域连接。其中Fc-DNGR-1和Fc-LOX-1显示对死细胞的明显结合，且Fc-DNGR-1的效价和效能最高，结合特异性针对膜完整性丧失的坏死细胞，而非活细胞或凋亡细胞。在缺乏坏死性吞噬能力的Hoxb8 cDC2s中，Fc-DNGR-1显著增强坏死细胞摄取（necrophagy）及交叉呈递。Fc-DNGR-1的功能需要F-actin识别和FcγR触发的桥接，因为F-actin结合缺陷型（2WA）或FcγR结合减弱型（N297A）突变体均 abolished 这些活性。

在IFNα预处理的初级FLT3L cDCs中，Fc-DNGR-1增强cDC1s和cDC2s的坏死性吞噬。CRISPR-Cas9介导的基因删除表明FcγRI对该过程重要。共聚焦显微镜显示WT Fc-DNGR-1促进每细胞多个坏死细胞尸体的内化。在交叉呈递实验中，非cDC1s原本不能有效交叉呈递坏死细胞相关OVA，但WT Fc-DNGR-1显著促进该活性，使其达到与cDC1s相当的水平。FcγRI敲除减弱此效应，而FcγRIIB敲除影响较小。

机制研究表明，FcγR信号触发吞噬体损伤。蛋白酶体抑制剂乳清霉素抑制Fc-DNGR-1介导的交叉呈递，而内体蛋白酶抑制剂亮抑酶肽无此效应，提示P2C的作用。利用RAW264.7巨噬细胞，发现IgG包被珠比对照珠显示更多的galectin-3积累及增强的eGFP信号，表明吞噬体膜损伤，且该过程受SYK和NADPH氧化酶抑制剂抑制。

空间分析显示，Fc-DNGR-1可在体内标记肿瘤坏死区域。在MCA205-LifeAct-OVA-mCherry肿瘤中，WT Fc-DNGR-1有效标记肿瘤中心坏死细胞。CD103? cDC1s位于远离Fc-DNGR-1?坏死区域的肿瘤外周，而MHC-II? CD103? APCs分布于整个肿瘤，包括坏死区域边界和内部。Clec9aCreRosaLSLtdTomato小鼠证实cDC2s表达FcγRI并浸润坏死区域。Xcr1Venus小鼠的高维显微镜显示XCR1? cDC1s定位于远离坏死的血管附近，而CD45?CD88?细胞（包括许多表达MHC-II者）大量浸润坏死区域。

在体内肿瘤控制实验中，WT Fc-DNGR-1与阿霉素化疗或X射线放疗联合使用可减弱MCA205肿瘤生长。LALA-PG突变型（更完全废除Fc效应功能）无此效果。在Batf3?/?小鼠（缺乏cDC1s）中，Fc-DNGR-1仍保留促进肿瘤控制的能力，表明其可通过非cDC1s的FcγRs发挥作用。抗CD8α抗体消除治疗活性证实CD8? T细胞的关键作用。Fc-DNGR-1在CT26和MC38模型中也显示单药活性。多柔比星增加CD88?Ly6Cint MHC-II? MCs的频率和绝对数量，这些MCs表达更高水平的FcγRI和FcγRIIB。WT Fc-DNGR-1增强PD-1?TIM-3? CD8? T细胞的频率，与祖细胞样表型一致。

研究人员还开发了抗F-actin单克隆抗体（AFA）。AFA与鬼笔环肽染色的F-actin丝共定位，结合人和小鼠坏死细胞，促进小鼠cDC1s和非cDC1s摄取坏死碎片及交叉呈递相关抗原。人IgG1格式的AFA及GASDALIE突变型（增强FcγR结合）促进人MCGM-CSF/IL-4细胞的坏死性吞噬，该过程可被FcγRIIA阻断抗体或SYK抑制剂抑制。WT和GASDALIE AFA增强共刺激分子HLA-DR和CD86的上调及炎症细胞因子（尤其TNF-α）的产生。

讨论部分指出，cDC1s可将坏死肿瘤细胞检测与肿瘤抗原特异性CD8? T细胞的启动和再刺激偶联以维持抗肿瘤免疫。而cDC2s、MCs和巨噬细胞在癌症抗原交叉呈递中作用较小，尽管它们在肿瘤中远多于cDC1s且更接近肿瘤坏死区域。研究表明将F-actin识别与FcγRs连接是使非cDC1 APCs变得与cDC1s同样有效的摄取坏死细胞碎片和交叉呈递死细胞相关抗原的手段。研究确定了吞噬体损伤作为FcγR触发后驱动抗原转位至胞质MHC-I通路的细胞机制。该策略不依赖于新生或过度表达的肿瘤特异性（新）抗原，而是靶向细胞死亡这一常见过程，后者可在肿瘤中自发发生或由化疗、放疗和抗体-药物偶联物等治疗诱导。Fc-DNGR-1在临床前模型中促进治疗性肿瘤控制并与化疗和放疗协同作用。扩大坏死细胞抗原的交叉呈递既可增强也可多样化正在进行的抗肿瘤CTL反应，并通过表位扩展在缺乏cDC1s的免疫冷肿瘤中诱导CTLs。研究显示cDC1s比cDC2s和MCs更远离坏死区域，突显了将坏死细胞碎片靶向FcγR?非cDC1s的治疗价值。新抗F-actin单克隆抗体的开发可能提供更大的临床适用性。

研究结论指出，这种将损伤相关分子模式（DAMP）检测与死细胞相关抗原交叉呈递偶联的方法基于自然免疫系统，揭示了抗原呈递调节机制如何被治疗性利用。值得注意的是，人类胰腺导管腺癌中最近报道了克隆扩增的抗F-actin IgG产生浆细胞，提示类似机制可能自然贡献于癌症患者的肿瘤控制。除DNGR-1外，其他DAMP受体和/或它们的细胞内靶点也可被利用以增强死细胞免疫原性。研究设计的类似Fc-DNGR-1的治疗药物可用于增强或抑制对死细胞的免疫，应用范围超出癌症，包括病毒感染、疫苗接种或自身免疫病。

**研究背景与科学问题**

传统树突状细胞1型（cDC1s）是抗肿瘤免疫中诱导细胞毒性CD8? T淋巴细胞（CTLs）及介导免疫检查点阻滞（ICB）疗效的关键抗原呈递细胞（APCs）。其核心功能在于摄取坏死肿瘤细胞碎片，并通过DNGR-1（CLEC9A）识别暴露的F-肌动蛋白（F-actin），进而经脾酪氨酸激酶（SYK）信号促进吞噬体至胞质的转运（P2C），实现交叉呈递（XP）。然而，cDC1s在人类及小鼠肿瘤中极为稀少，其数量不足严重制约抗肿瘤免疫效应。与此同时，肿瘤内大量存在的cDC2s和单核细胞来源细胞（MCs）等非cDC1 APCs虽具备免疫调节潜能，却缺乏有效的坏死细胞抗原呈递能力。如何激活这些丰度更高且空间上更接近坏死区域的APCs，成为突破现有免疫治疗瓶颈的重要科学问题。

**研究发现与核心结论**

研究人员提出创新策略：通过构建F-actin识别与Fcγ受体（FcγR）信号的人工偶联，重定向非cDC1 APCs执行坏死细胞抗原的摄取与交叉呈递。研究证实，Fc-DNGR-1融合蛋白及抗F-actin抗体（AFA）可桥接F-actin与FcγRs，使cDC2s和MCs获得媲美cDC1s的坏死性吞噬（necrophagy）和抗原交叉呈递能力。该过程依赖FcγRI的信号传导，并触发SYK-NADPH氧化酶介导的吞噬体膜损伤，实现抗原的胞质转运。在体实验表明，Fc-DNGR-1能靶向肿瘤坏死区域，与化疗或放疗协同抑制肿瘤生长，且其疗效在cDC1s缺陷的Batf3?/?小鼠中得以保留，证实非cDC1 APCs的关键作用。论文发表于《Nature Cancer》，为开发不依赖cDC1s的广谱抗肿瘤免疫策略提供理论基础。

**关键技术方法概述**

研究综合运用单细胞RNA测序（scRNA-seq）泛癌髓系细胞图谱（498,023细胞、589样本、12种肿瘤类型）与多重流式细胞术分析人和小鼠肿瘤APCs组成；采用Hoxb8永生化系统建立cDC2模型，结合CRISPR-Cas9基因编辑敲除Fcgr基因；利用共聚焦显微镜及高维空间成像技术（MACSima迭代染色系统）解析肿瘤内APCs空间分布；通过phage展示技术筛选抗F-actin人源Fab片段并构建嵌合抗体；建立体外交叉呈递检测体系及MCA205、MC38、CT26等多种小鼠肿瘤模型评估体内疗效，包括联合阿霉素化疗和X射线放疗方案。

**主要研究结果**

**FcγR? APCs在肿瘤中丰富并交叉呈递IgG结合蛋白**：人类泛癌分析显示cDC1s在肿瘤中被cDC2s和经典单核细胞显著超越；小鼠MCA205、MC38及BRAF^V600E模型证实CD88? MCs和CD172a? cDC2s占绝对多数且随肿瘤进展积累。人类cDC2s和单核细胞普遍表达激活型FcγRIIA及抑制型FcγRIIB，小鼠肿瘤微环境中cDC2s和MCs高表达FcγRI、FcγRIV和FcγRIIB。这些FcγRs具有功能活性，介导OVA免疫复合物（ICs）摄取，肿瘤来源CD88? MCs可有效交叉呈递至CD8? T细胞，而脾来源同类细胞无此能力。

**Fc-CLRs偶联坏死细胞结合至坏死性吞噬和交叉呈递**：设计六种Fc-C型凝集素受体（CLR）融合蛋白，仅Fc-DNGR-1和Fc-LOX-1特异性结合坏死细胞（非活细胞或凋亡细胞），其中Fc-DNGR-1效价最高（EC₅₀=4.82 nM）。在缺乏坏死性吞噬能力的Hoxb8 cDC2s中，Fc-DNGR-1显著增强坏死细胞摄取（EC₅₀=0.54 nM）及OVA交叉呈递，而Fc-LOX-1效果较弱，Fc-Dectin-1无效。特异性对照实验显示，F-actin结合缺陷型2WA突变体和FcγR结合减弱型N297A突变体均 abolished 该功能，证实双重桥接必要性。

**Fc-DNGR-1经FcγRI促进cDCs的坏死性吞噬和交叉呈递**：初级FLT3L cDCs中，IFNα预处理可上调FcγR表达至肿瘤cDCs水平。Fc-DNGR-1增强cDC1s和cDC2s的坏死性吞噬，CRISPR-Cas9敲除Fcgr1显著减弱此效应。交叉呈递实验表明，WT Fc-DNGR-1使原本无效的非cDC1s获得与cDC1s相当的交叉呈递能力，而FcγRI敲除减弱该效应。Fc-DNGR-1还增强naive CD8? T细胞的交叉启动及髓系细胞激活。

**FcγR信号触发吞噬体损伤**：机制上，蛋白酶体抑制剂乳清霉素抑制Fc-DNGR-1介导的交叉呈递，而内体蛋白酶抑制剂亮抑酶肽无此效应。利用RAW264.7巨噬细胞体系，发现IgG包被珠较对照珠显示更多galectin-3募集及胞质eGFP流入吞噬体，提示吞噬体膜通透性增加；SYK抑制剂R406和NADPH氧化酶抑制剂DPI减弱galectin-3信号，表明FcγR-SYK-NADPH氧化酶轴驱动吞噬体损伤和P2C。

**FcγR? APCs在肿瘤中定位于坏死细胞邻近区域**：Fc-DNGR-1作为成像工具标记肿瘤坏死核心。空间分析揭示cDC1s定位于远离坏死区域的肿瘤外周，而MHC-II? CD103? APCs、Clec9a谱系示踪的cDC2s及CD88? MCs大量浸润坏死区域。Xcr1^Venus小鼠高维成像显示XCR1? cDC1s邻近血管，CD88?髓系细胞富集于坏死区。

**Fc-DNGR-1促进FcγR依赖性肿瘤控制**：治疗性给予Fc-DNGR-1联合阿霉素或放疗显著抑制MCA205肿瘤生长。LALA-PG突变型（废除Fc效应功能）丧失疗效；Batf3?/?小鼠中WT Fc-DNGR-1保留疗效，证实非cDC1s机制；抗CD8α抗体消除治疗效应。单药治疗在CT26和MC38模型中亦有效。化疗增加CD88?Ly6C^int MHC-II? MCs浸润及其FcγR表达；Fc-DNGR-1治疗增强PD-1?TIM-3? CD8? T细胞频率，提示祖细胞样表型。

**抗F-actin抗体促进人APCs坏死性吞噬和细胞激活**： orthogonal策略采用抗F-actin Affimer-Fc及phage展示筛选的抗F-actin单克隆抗体AFA。AFA与F-actin特异性结合，促进小鼠cDC1s和非cDC1s的坏死性吞噬及交叉呈递。人IgG1格式AFA及其GASDALIE突变型（增强FcγR结合）促进人MC_GM-CSF/IL-4细胞的坏死性吞噬，该过程受FcγRIIA阻断抗体和SYK抑制剂抑制，并伴随HLA-DR、CD86上调及TNF-α产生。

**讨论与结论**

该研究基于天然免疫系统中DAMP检测与交叉呈递偶联机制，创新性地将F-actin识别重定向至FcγR信号，使非特化APCs获得cDC1s样的交叉呈递能力。研究确定吞噬体损伤作为FcγR介导P2C的核心细胞机制。此方法不依赖特定肿瘤抗原，而是靶向普遍存在的细胞死亡过程，与化疗、放疗等诱导细胞死亡的治疗策略具有天然协同性。空间分析揭示的cDC1s与坏死区域的物理隔离，突显了靶向FcγR?非cDC1s的独特优势。研究为开发新型抗肿瘤生物制剂（如Fc-DNGR-1和抗F-actin抗体）奠定基础，并提示类似机制可能参与人类天然抗肿瘤免疫（如胰腺导管腺癌中克隆扩增的抗F-actin浆细胞）。未来需进一步验证其在免疫冷肿瘤及原位模型中的疗效，并探索与免疫检查点阻滞的联合应用。该策略的延伸应用亦可拓展至感染、疫苗和自身免疫病等领域。