一种结合CRISPR/Cas9与腺相关病毒通过定点基因整合制备CAR-γδ T细胞的新型策略

《Cancer Medicine》：A Novel Strategy to Produce CAR-γδ T Cells via Site-Directed Gene Integration by a Combination of CRISPR/Cas9 and AAV

嵌合抗原受体（CAR）-αβ T细胞已广泛应用于肿瘤治疗，但仍存在一定局限性。γδ T细胞因具备主要组织相容性复合体（MHC）非限制性识别模式及天然免疫功能，是CAR治疗的理想候选底物。本研究建立一种制备CAR-γδ T细胞的新型方法：研究人员利用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）系统切割TCR δ链恒定区（TRDC）序列，随后通过腺相关病毒（AAV）介导的同源重组，将CAR序列定点插入TRDC位点。研究人员优化了Cas9/核糖核蛋白（RNP）的电转参数及携带CAR基因的AAV感染条件，实现了高效的TCR敲除与定点CAR插入，最终获得功能性CAR-γδ T细胞。体外实验表明，该类细胞可诱导细胞因子分泌、杀伤肿瘤细胞，并具备较强的增殖潜能及记忆样表型；体内实验证实其可降低荷瘤小鼠肿瘤负荷并延长生存期。

本研究发表于《Cancer Medicine》，针对现有CAR-T细胞治疗实体瘤疗效有限、免疫逃逸及脱靶毒性等问题，以及传统γδ T细胞制备中慢病毒或γ逆转录病毒载体存在的随机插入致恶变风险，提出一种基于CRISPR/Cas9与AAV的定点基因整合策略，首次实现CAR在γδ T细胞TRDC位点的靶向敲入，兼具安全性与功能优势，为通用型CAR-T研发提供了新路径。

研究人员采用的关键技术方法包括：从健康志愿者外周血单个核细胞（PBMC）经唑来膦酸联合白细胞介素2诱导扩增γδ T细胞；设计靶向TRDC位点的sgRNA并优化Cas9/RNP电转体系；利用AAV6携带同源臂及CAR表达框实现定点同源重组修复；通过流式细胞术检测TCR敲除效率、CAR表达水平、细胞表型及功能；采用体外共培养模型评估细胞因子分泌、增殖及杀伤活性；构建NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52Il2rgem26Cd22/Gpt（NCG）小鼠急性淋巴细胞白血病异种移植模型验证体内抗肿瘤效果。

研究结果如下：

2.1 利用唑来膦酸（ZOL）和IL2从PBMC扩增γδ T细胞

研究人员比较不同细胞因子组合对γδ T细胞扩增的影响，发现ZOL联合IL2或IL7/IL15均可获得纯度超70%的γδ T细胞，其中ZOL/IL2组细胞扩增倍数达约140倍，且耗竭分子（PD1、TIM3、LAG3）表达更低，因此选定该条件用于后续实验。

2.2 Cas9/RNP电转实现人γδ T细胞高效TCR敲除

通过TIDE分析及γδ T细胞表面TCR表达筛选，确定靶向TRDC的高效sgRNA（gRNA1）可实现约80%的TCR敲除率。进一步系统优化电转程序、gRNA与Cas9比例、Cas9用量及转染细胞数，最终确立最优参数：Lonza IIB X001程序，gRNA:Cas9摩尔比4:1，Cas9用量10 μg，单次转染细胞数1–2×10⁶，TCR敲除效率可达90%，同时维持较高细胞活力与回收率，该体系亦可实现约70%的HLA敲除效率。

2.3 AAV6转导实现人γδ T细胞定点CAR敲入

AAV6可高效转导γδ T细胞，EGFP报告病毒转导效率达90%。研究人员构建含左右同源臂（各400 bp）的AAV6载体，将CAR表达框定点插入TRDC位点外显子3。通过优化电转后感染时机、感染复数（MOI）及培养时间，确定PBMC经ZOL/IL2刺激5天后采用X001程序电转，随后以MOI 1.2×10⁵感染AAV6为最优方案，CAR定点敲入效率约20%，细胞长期扩增稳定，记忆表型（CD62L⁺）比例更高，CAR表达持续稳定。

2.4 CAR-γδ T细胞体外抗肿瘤功能

靶向CD19的CAR-γδ T细胞与CD19阳性Nalm6细胞共培养后，可显著分泌干扰素γ（IFNγ）及肿瘤坏死因子α（TNFα），而未转导（UTD）γδ T细胞无此效应。CAR-γδ T细胞静息及抗原刺激后均富含初始/中央记忆亚群（CD45RA⁺CD62L⁺、CD45RA^?CD62L⁺），CFSE增殖实验显示其抗原依赖性增殖能力强于UTD组；在不同效靶比下，CAR-γδ T细胞对Nalm6及Raji细胞的裂解率均显著高于UTD组，且培养至21天仍保持同等杀伤活性。

2.5 CAR-γδ T细胞在异种移植小鼠模型中抑制肿瘤生长

在NCG小鼠急性淋巴细胞白血病模型中，分别于肿瘤细胞接种后4天及11天静脉输注等量UTD或CAR-γδ T细胞，并每周三次腹腔注射人重组IL2。结果显示CAR-γδ T细胞可有效抑制肿瘤负荷，显著延长小鼠生存期；UTD γδ T细胞虽在体外有一定杀伤作用，但在体内未表现出明显抑瘤效果。

讨论部分指出，传统CAR-γδ T细胞制备依赖慢病毒或转座子系统，存在随机插入、CAR表达异质性及长期沉默等风险。本研究首次将CRISPR/Cas9与AAV6定点整合策略应用于γδ T细胞，利用内源性TRDC启动子驱动CAR表达，避免了外源启动子的不确定性，同时减少了插入突变风险。研究亦提示，TRDC敲除可能部分削弱γδ T细胞天然肿瘤识别能力，未来可通过优化CAR胞内信号域（如引入DAP10、NKG2D等天然受体信号）增强功能；此外，体内肿瘤微环境中的抑制性分子（如PD-L1、TGF-β）可能影响细胞持久性，需进一步探索联合阻断策略。AAV在γδ T细胞中的长期安全性尚未见报道，仍需系统评估。总体而言，该研究为γδ T细胞的精准基因编辑提供了可靠方案，也为开发更安全、通用的现货型CAR-T产品奠定了基础。