《Nature Cell Biology》：In situ cryo-ET defines the ultrastructure of ER exit sites in human cells
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分泌蛋白从内质网（ER）向高尔基体（Golgi apparatus）的转运是真核细胞中约30%蛋白质正确定位的首要关键步骤。COPII（coat protein complex II）和COPI（coat protein complex I）分别介导顺向和逆向
分泌蛋白从内质网（ER）向高尔基体（Golgi apparatus）的转运是真核细胞中约30%蛋白质正确定位的首要关键步骤。COPII（coat protein complex II）和COPI（coat protein complex I）分别介导顺向和逆向运输，负责货物及货物受体在内质网与高尔基体之间的转运。尽管体外实验已证实COPII可形成包被囊泡，但在哺乳动物细胞中，运输载体的生物发生、形态与组织方式仍存在争议。研究人员采用原位冷冻电子断层扫描（in situ cryo-electron tomography, cryo-ET）和超分辨率荧光显微术，在未受药物处理、温度阻断或过表达干扰的人类细胞中揭示了ER出口位点（ER exit sites, ERES）的分子结构。研究发现核糖体排斥区富含COPII与COPI包被囊泡，解决了关于COPII包被囊泡是否存在的争论。COPII囊泡起源于ER膜，而COPI囊泡则来自构成ER–高尔基中间区室（ER–Golgi intermediate compartment, ERGIC）的囊泡管状簇。研究人员量化了包被囊泡的形态及其相对于ERES其他组分的空间位置，提供了哺乳动物早期分泌途径分子组织的详细描述。
该研究针对哺乳动物细胞中内质网（ER）至高尔基体（Golgi apparatus）的早期分泌途径机制展开，旨在解决长期存在的争议。背景方面，分泌途径负责约30%真核蛋白的定位，其核心是由COPII（coat protein complex II）和COPI（coat protein complex I）介导的囊泡运输，但哺乳动物细胞中ER出口位点（ER exit sites, ERES）的结构及运输模式存在两种对立模型：经典的小囊泡模型与近期提出的管状隧道模型。争议焦点在于COPII是否真正形成包被囊泡，以及大体积货物如何穿过ERES。研究人员在未扰动的人类视网膜色素上皮（RPE-1）细胞中，结合冷冻电子断层扫描（cryo-ET）、冷冻关联光镜与电镜（cryo-CLEM）及超分辨荧光显微术（STED），首次在原生细胞环境中可视化ERES的超微结构，证实了COPII和COPI包被囊泡的存在，并量化了其形态与空间分布，为早期分泌途径提供了分子层面的组织图谱。该成果发表于《Nature Cell Biology》。
关键技术方法包括：在CRISPR编辑的内源性标记HaloTag-Sec23A RPE-1细胞系中，利用冷冻聚焦离子束铣削（cryo-FIB/SEM）制备细胞薄片，通过原位冷冻电子断层扫描（cryo-ET）获得高分辨三维结构；结合冷冻关联光镜与电镜（cryo-CLEM）精确定位ERES区域；采用超分辨受激发射损耗显微术（STED）和共聚焦荧光成像量化ERES组分的空间关系；通过模板匹配（template matching）与亚断层平均（subtomogram averaging）识别并验证COPII与COPI包被结构。
研究结果如下：
Identification of ERES in situ：研究人员开发了低剂量、高离焦的断层扫描靶向策略，成功在63个断层图中定位ERES区域，其特征是核糖体密度较周围降低11.5倍，形成直径约483 nm的核糖体排斥区。
Identification of COPII and COPI coats within ERES：通过模板匹配与亚断层平均，明确了COPII包被由致密内层与稀疏外层组成，厚度约15 nm；COPI包被呈厚约50 ?的均匀层。两者在结构上与体外重建结果一致，解决了识别争议。
The organization of COPII and COPI vesicles at ERES：COPII包被结构（95个囊泡、62个芽）附着于ER膜或游离于附近；COPI包被结构（39个囊泡、148个芽）源自ERGIC膜。两者在三维空间中部分重叠但保持分离，最近距离集中在100–200 nm。荧光成像显示COPII与过渡ER标志Sec16A中位距离106 nm，与COPI中位距离204 nm。
Transport carrier morphology at ERES：COPII囊泡中位体积180,760 nm3（直径约70 nm），COPI囊泡中位体积134,153 nm3（直径约64 nm），均接近球形。COPII更易形成游离囊泡，而COPI更多处于芽状，提示两者脱壳与剪切时间尺度不同。
Cellular context of ERES：ERES分为近核与外周两类，均与ERGIC共存。微管、中间丝及肌动蛋白丝在ERES与非ERES断层图中出现频率无显著差异，不支持其在ERES特异性作用。
TFG tethers COPII vesicles at ERES：超分辨成像显示TFG（TRK-fused gene protein）环绕COPII囊泡分布，支持其通过聚集COPII载体促进脱壳与拴系，而非作为隔离COPI的物理屏障。
讨论部分总结：该研究否定了管状隧道与COPII领圈模型，确立了哺乳动物ERES以COPII包被囊泡为主要运输形式的经典模型。COPII囊泡由ER出芽，经TFG聚集后脱壳并与ERGIC融合；COPI囊泡则从ERGIC出芽，负责回收货物受体及逃逸的ER驻留蛋白。研究还指出，COPII与COPI囊泡在形态、大小及动态行为上的差异反映了其组装与调控机制的特异性。对于胶原蛋白等超大货物的运输机制，研究人员认为可能通过调节COPII包被动力学产生较大或管状载体，而非完全重构运输机制。该工作为理解早期分泌途径提供了高分辨率结构基础，并指出未来需在神经元及特化分泌细胞中进一步探索ERES的组织多样性。
