百合‘Sally’茎段离体再生及农杆菌介导遗传转化体系的建立

《Scientia Horticulturae》：Establishment of an in vitro regeneration and Agrobacterium-mediated genetic transformation system for Lilium longiflorum ‘Sally’ stem segments

　　

百合（Lilium longiflorum）是重要的商品观赏作物，但其遗传改良受常规育种周期长、效率低的限制。本研究以百合‘Sally’茎段为外植体，旨在建立高效离体再生及农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导遗传转化体系。结果表明，添加1.0 mg/L 毒莠定（PIC）与0.2 mg/L α-萘乙酸（NAA）的MS培养基愈伤组织诱导率最高，达77.78%；不定芽分化最优组合为1.5 mg/L 6-苄氨基嘌呤（6-BA）与0.5 mg/L NAA，成功率为68.00%。遗传转化最优参数为农杆菌密度OD600=0.8、侵染10分钟，并以300 mg/L 头孢噻肟钠（Cef）抑制细菌生长。利用该体系验证了ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（LiAGPase）基因在淀粉代谢中的功能：过表达株系淀粉含量显著上升，CRISPR/Cas9介导的基因编辑获得错义突变体（赖氨酸→谷氨酰胺），淀粉积累降至野生型的43.3%。该研究为百合分子育种提供了技术平台，并阐明LiAGPase基因调控淀粉合成的机制，为鳞茎品质改良奠定基础。

本研究发表于《Scientia Horticulturae》，针对百合（Lilium spp.）基因组庞大（约35.6 Gb）、世代周期长、杂合度高导致传统育种难以精准引入抗病抗逆等优异性状的瓶颈，以主栽品种‘Sally’为材料，建立了基于茎段的离体再生与农杆菌介导遗传转化体系，并解析了ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（LiAGPase）基因在鳞茎淀粉积累中的功能，为鳞茎品质分子育种提供了理论与技术支撑。

关键技术方法包括：以云南大学农学院提供的百合‘Sally’无菌苗茎段为外植体，通过植物生长调节剂配比优化建立四阶段离体再生体系；采用抗生素敏感性试验确定筛选压，结合农杆菌侵染参数优化建立遗传转化体系；构建LiAGPase基因过表达载体与CRISPR/Cas9基因编辑载体，经农杆菌转化获得遗传修饰植株；通过PCR、qRT-PCR、GUS组织化学染色及Sanger测序进行转基因鉴定；采用淀粉检测试剂盒测定鳞茎淀粉含量，结合统计学分析验证表型差异。

研究结果如下：

3.1 百合‘Sally’离体再生体系的建立与优化

3.1.1 植物生长调节剂对愈伤组织诱导的影响：无激素对照几乎无愈伤形成，1.0 mg/L PIC+0.2 mg/L NAA处理愈伤诱导率最高（77.78%），褐化率最低（7.78%），且后续不定芽分化潜力最强（71.11%）。

3.1.2 不定芽诱导及鳞茎发生：1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA不定芽分化率最高（68.00%），培养90天可形成15–20个芽簇；全量MS培养基+0.2 mg/L NAA鳞茎诱导效果最优，平均单外植体产鳞茎75个，平均直径1.21 cm，显著高于对照。

3.2 农杆菌介导遗传转化体系的优化

3.2.1 筛选条件的确定：300 mg/L Cef在有效抑制农杆菌的同时维持50.00%的不定芽分化率；草铵膦（Glu）最优筛选浓度为1.5 mg/L（非转化组织褐化率达86.67%）；pRI101载体（含nptII基因）对愈伤和鳞片外植体的最适卡那霉素浓度分别为75 mg/L和100 mg/L，可完全抑制非转化组织生长。

3.2.2 侵染条件优化：农杆菌OD₆₀₀=0.8、侵染10分钟时瞬时GUS表达率最高（5.7%）。

3.3 LiAGPase基因过表达促进淀粉积累

3.3.1 过表达载体构建与验证：成功克隆LiAGPase基因全长CDS（1890 bp），构建重组载体pRI101-AGPase并经酶切与测序验证。

3.3.2 转基因株系获得与鉴定：经抗性筛选获得7株再生植株，PCR与GUS染色证实5株为阳性，qRT-PCR显示其LiAGPase转录水平显著上调。

3.3.3 过表达株系淀粉含量升高：4个过表达株系鳞茎淀粉含量显著高于野生型，且淀粉含量与LiAGPase表达水平呈显著正相关（P<0.05）。

3.4 CRISPR-Cas9介导LiAGPase基因编辑抑制淀粉合成

3.4.1 基因编辑突变体获得与鉴定：获得6株抗性植株，测序发现1个突变体在第编码区发生A>C碱基替换，导致赖氨酸（Lys）→谷氨酰胺（Gln）错义突变。

3.4.2 基因编辑植株表达下调与淀粉减少：突变体LiAGPase转录水平降至野生型的62.4%，鳞茎淀粉含量降至野生型的43.3%，二者呈极显著正相关（r=0.944）。

讨论部分指出，茎段外植体较传统鳞片污染率低且再生能力强，PIC作为强效生长素在单子叶植物愈伤诱导中具有优势，其最优浓度因物种与发育途径而异；不同百合基因型对细胞分裂素与生长素的响应差异显著，体现了离体形态发生的基因型依赖性；农杆菌转化中筛选压与侵染参数的优化需兼顾抑菌效果与外植体存活，百合‘Sally’茎段对农杆菌耐受性较高；LiAGPase是百合鳞茎淀粉合成的关键限速节点，其表达量与淀粉积累正相关，但受下游淀粉合酶与蔗糖卸载能力的协同调控，单基因过表达存在饱和效应；CRISPR/Cas9介导的错义突变虽未完全敲除基因，但已显著降低酶活性与淀粉积累，证明该基因是鳞茎产量改良的重要靶点。

结论部分表明，本研究成功建立了百合‘Sally’茎段高效离体再生与农杆菌介导遗传转化体系，明确了1.0 mg/L PIC+0.2 mg/L NAA为愈伤诱导最优配方，1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA为不定芽分化最优配方，OD₆₀₀=0.8、侵染10分钟及300 mg/L Cef为最优转化参数；通过过表达与CRISPR/Cas9编辑双向验证了LiAGPase基因正向调控鳞茎淀粉积累的功能，为百合分子育种与功能基因组学研究提供了可靠技术平台与基因资源。