《Neuropsychopharmacology》：Carprofen and buprenorphine delivery using micropipette-guided drug administration (MDA) in mice
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精炼化的、非侵入性的镇痛递送方法对于提高实验用啮齿动物研究的动物福利和伦理标准至关重要。在此，研究人员评估了微量移液器引导给药（MDA）方法是否能达到两种广泛使用的镇痛药（即卡洛芬和丁丙诺啡）的治疗相关血浆和脑浓度。该方法利用加糖炼乳作为载药媒介以促进动物自愿
精炼化的、非侵入性的镇痛递送方法对于提高实验用啮齿动物研究的动物福利和伦理标准至关重要。在此，研究人员评估了微量移液器引导给药（MDA）方法是否能达到两种广泛使用的镇痛药（即卡洛芬和丁丙诺啡）的治疗相关血浆和脑浓度。该方法利用加糖炼乳作为载药媒介以促进动物自愿摄食，研究对象为雄性及雌性C57BL/6 N和BALB/c小鼠。卡洛芬通过MDA以5、15和30 mg/kg的剂量给药，产生了量效关系，并且血浆暴露量与相同剂量的常规皮下（SC）注射后观察到的结果相当，其血浆浓度以剂量依赖的方式超过了推荐的~25 μg/mL治疗阈值。相比之下，给药途径显著影响了丁丙诺啡的血浆和脑浓度，为了补偿首过代谢（first-pass metabolism），MDA组的丁丙诺啡给药剂量（0.5、1.0和2.0 mg/kg）高于SC注射组（0.05、0.1和0.2 mg/kg）。具体而言，丁丙诺啡的SC注射在早期给药后产生较高的血浆浓度，而MDA则导致血浆水平达峰时间剂量依赖性延迟，并导致主要代谢物丁丙诺啡-3-葡萄糖醛酸苷（buprenorphine-3-glucuronide）的血浆浓度较高。尽管两种给药途径的丁丙诺啡血浆浓度均未达到推荐的治疗阈值（1 ng/mL），但在治疗后8小时，所有MDA丁丙诺啡剂量组的脑浓度均超过了提议的效能阈值（3–5 ng/g）。总之，研究结果表明，MDA为镇痛治疗的肠外注射提供了有效的替代方案，同时强调了除了血浆浓度外，评估中枢药物暴露的重要性。
研究背景与意义：
在实验室啮齿动物研究中，有效的疼痛管理对于维持动物福利的伦理标准以及减少实验操作后疼痛诱导的生理和行为变化至关重要。目前啮齿动物镇痛的标准通常涉及皮下（SC）或腹腔（IP）注射镇痛药。虽然这些途径可以精确控制剂量和时间，但也会引发急性应激反应并造成额外的轻度疼痛。这些不良影响可能增加动物的整体疼痛负担，延迟术后恢复，并引入生理和行为结果的可变性。因此，通过开发非侵入性、压力最小的药物递送系统来确保药效和改善动物福利，从而优化当前镇痛治疗方法的需求日益增长。先前已有研究探索了非侵入性给药方法，如将药物掺入标准食物或饮水、可口零食（如糖曲奇面团球、明胶糖果或加糖坚果酱）以及水凝胶递送系统，但这些替代方法存在剂量和时间控制困难、动物不愿食用等局限性。
为解决这些局限，研究人员最近开发并引入了微量移液器引导给药（Micropipette-guided drug administration, MDA）方法，这是一种用于实验啮齿动物急性和慢性经口（per os）治疗的非侵入性和最小压力技术。该方法利用实验室啮齿动物对甜物质的天然偏好，使用稀释的加糖炼乳作为可口载体，鼓励动物自愿从微量移液器中摄入含药溶液。标准MDA方案包括简短的训练阶段，小鼠在最小或无约束的情况下训练消耗基于牛奶的载体。与通过常规技术（如IP注射或口服灌胃）的载体或药物给药不同，MDA程序不会触发应激激素皮质酮的释放，且作为MDA载体的稀释加糖炼乳不会改变小鼠的肠道微生物组组成。因此，MDA代表了实验啮齿动物药物递送的一种有前景的替代方法，具有自愿、非侵入、压力最小给药的关键优势，同时保持对治疗时间和剂量的精确控制。然而，尽管MDA的实用性已在化学遗传学、诱导基因表达系统、代谢测试和奖励相关行为的临床前研究等一系列应用中得到证实，但其递送镇痛药物的适用性和效能尚未得到评估。
因此，本研究旨在调查通过MDA给药的镇痛药是否能达到有效镇痛所需的治疗相关血浆和脑浓度，并与常规SC注射途径进行比较。研究人员聚焦于阿片类镇痛药丁丙诺啡（buprenorphine）和非甾体抗炎药（NSAID）卡洛芬（carprofen），这是啮齿动物疼痛管理中两种最常用的镇痛药。研究采用量效实验设计，针对两种广泛使用的近交系小鼠品系（即C57BL/6和BALB/c），并纳入雄性和雌性小鼠以评估可能的性别依赖性效应。该论文发表在《Neuropsychopharmacology》。
主要关键技术方法：
研究人员使用了从Charles River Laboratories来源的10周龄雄性及雌性C57BL/6 N（各30只）和BALB/c小鼠（各30只）。药物包括卡洛芬（Rimadyl?）和丁丙诺啡（Temgesic?溶液）。MDA操作使用稀释的加糖炼乳（4:10奶水比）作为载体，通过标准单通道p200微量移液器给药；SC注射使用0.9% NaCl作为溶剂。卡洛芬给药剂量为5、15、30 mg/kg（MDA和SC相同），丁丙诺啡SC剂量为0.05、0.1、0.2 mg/kg，MDA剂量为0.5、1.0、2.0 mg/kg（因首过代谢提高10倍），所有溶液给药体积均为2 ml/kg。血样通过侧尾静脉切开术（6和12小时用于卡洛芬；1和4小时用于丁丙诺啡）或脱颈处死（24小时用于卡洛芬；8小时用于丁丙诺啡）收集，脑样本在终末时间点收集。血浆和脑中的药物及代谢物浓度通过液相色谱/质谱（LC/MS）定量。统计分析使用SPSS和Prism软件，显著性设定为p < 0.05。
研究结果：
通过MDA或SC注射给药后的卡洛芬（carprofen）血浆暴露
卡洛芬在所有实验条件下的所有血浆样本中均可检测到。在C57BL/6 N和BALB/c小鼠中，卡洛芬的血浆浓度随给药剂量成比例增加。在两个品系中，卡洛芬的最高浓度在给药后6小时测得，最低浓度在24小时，导致采样间隔的显著主效应。尽管在MDA或SC给药后观察到类似效应，但给药途径显著影响卡洛芬血浆水平，其变异取决于剂量、性别和采样间隔。在C57BL/6 N雄性小鼠中，通过MDA给药15 mg/kg卡洛芬导致血浆浓度低于SC注射（12和24小时显著）；30 mg/kg时MDA在各采样间隔均产生较低血浆水平。雌性C57BL/6 N小鼠也观察到类似影响。在BALB/c雄性小鼠中，30 mg/kg MDA给药导致较低血浆浓度（6和24小时显著）；雌性BALB/c小鼠中，15 mg/kg MDA在12小时较低，30 mg/kg在6小时较低。与推荐治疗阈值（25 μg/mL）比较表明，两个品系和性别中，SC或MDA给药最高剂量（30 mg/kg）在给药后6和12小时持续产生超过阈值的血浆浓度；24小时时超阈值浓度仍可检测，但受品系、性别和途径调节。5 mg/kg时超阈值浓度仅在6小时观察到，且限于特定组和品系/性别。15 mg/kg产生的暴露曲线介于5和30 mg/kg之间。
通过MDA或SC注射给药后的丁丙诺啡（buprenorphine）血浆暴露
无论给药途径、品系或性别，在给药后1和4小时收集的所有血浆样本中均可检测到丁丙诺啡，而在8小时收集的样本中，超过95%的浓度低于检测限（0.0015 ng/mL），因此后续分析限于1和4小时时间点。C57BL/6 N和BALB/c小鼠的血浆丁丙诺啡浓度均以剂量依赖方式增加。给药途径以部分取决于剂量和性别的方式显著影响血浆丁丙诺啡浓度。SC给药在所有剂量、品系和性别中，1小时时的血浆丁丙诺啡浓度高于4小时。此外，当药物通过SC给药而非MDA时，1小时采样间隔的血浆丁丙诺啡水平始终较高。相反，MDA与给药后1小时到4小时血浆丁丙诺啡浓度上升相关，符合血浆暴露达峰延迟的模式。这在接受MDA 1.0或2.0 mg/kg丁丙诺啡的雌性C57BL/6 N小鼠、接受MDA 2.0 mg/kg的雌性BALB/c小鼠以及接受任一剂量的雄性BALB/c小鼠中显而易见。在所有实验条件下，丁丙诺啡的血浆浓度均低于推荐的治疗阈值（1 ng/ml）。
通过MDA或SC注射给药后的丁丙诺啡-3-葡萄糖醛酸苷（buprenorphine-3-glucuronide）血浆暴露
由于丁丙诺啡口服给药经历显著的首过代谢，研究人员额外量化了其代谢物丁丙诺啡-3-葡萄糖醛酸苷的血浆浓度（在最早时间点1小时处理后）。C57BL/6 N和BALB/c小鼠的血浆丁丙诺啡-3-葡萄糖醛酸苷浓度均以剂量依赖方式增加。给药途径显著影响血浆丁丙诺啡-3-葡萄糖醛酸苷浓度，事后分析显示，在所有剂量、品系和性别中，MDA后的血浆浓度始终高于SC。
通过MDA或SC注射给药后的丁丙诺啡（buprenorphine）脑暴露
虽然在终末采样间隔（给药后8小时）超过95%的样本中血浆丁丙诺啡浓度低于检测限，但在此时点所有脑样本中均可检测到丁丙诺啡，无论给药途径、品系或性别。脑丁丙诺啡浓度在C57BL/6 N和BALB/c小鼠中以剂量依赖方式增加。给药途径显著影响脑丁丙诺啡暴露，事后分析显示，在所有剂量、品系和性别中，MDA后的脑浓度始终高于SC。与推荐治疗阈值（3-5 ng/g脑组织）比较显示，所有MDA丁丙诺啡剂量均导致脑组织水平超过推荐阈值（即使应用更保守的5 ng/g阈值），且在两个品系和性别中均观察到这种超阈值浓度。相反，SC给药后一致的超阈值脑浓度仅在高剂量（0.2 mg/kg）检测到，而中间和低剂量SC给药的脑水平分别在该阈值附近波动或低于该阈值。
讨论与结论总结：
作为持续验证MDA方法作为实验啮齿动物药物递送改进（refinement）的一部分，本研究评估了其在雄性及雌性C57BL/6 N和BALB/c小鼠中给药镇痛药的适用性。研究人员发现卡洛芬在SC和MDA给药后显示出相似的量效关系和总体时间血浆分布。与SC注射相比，MDA给药后的卡洛芬血浆暴露略低，可能由于啮齿动物口服生物利用度比肠外给药约低10%。相比之下，丁丙诺啡的血浆和脑暴露在SC和MDA给药之间存在显著差异。SC注射在最早采样间隔一致产生较高血浆浓度，而MDA导致血浆浓度达峰时间剂量依赖性延迟（因性别和品系而异）。尽管选定的丁丙诺啡给药方案未产生超过常用推荐治疗阈值1 ng/mL的血浆浓度，但通过MDA给药的丁丙诺啡在治疗后8小时所有检查剂量下均超过提议的脑阈值水平（3-5 ng/g），即使使用更保守的5 ng/g脑组织阈值作为比较也是如此。
在卡洛芬血浆暴露方面，研究结果与先前评估C57BL/6 J和CD1小鼠肠外给药的药代动力学研究一致。通过SC或MDA给药15或30 mg/kg卡洛芬后，血浆浓度在给药后长达12小时保持在推荐约25 μg/mL的治疗阈值以上。在给药后24小时，仍可检测到超阈值水平，但受品系、性别和给药途径调节。然而，选定的丁丙诺啡给药方案未产生超过常用推荐治疗阈值的血浆浓度，这出乎意料，因为此处检查的SC剂量（0.05、0.1和0.2 mg/kg）属于当前实验室小鼠指南推荐的镇痛管理范围，且可比剂量先前报道产生的血清、血浆或全血浓度高于提议的治疗阈值。但是，在该剂量范围内SC给药丁丙诺啡后的峰值血液暴露存在显著变异性，可能受品系、性别、血样类型（如全血与血清或血浆）和分析方法影响。例如，全血中丁丙诺啡定量可能产生比血清或血浆更低的计算浓度（因丁丙诺啡与血液蛋白强结合）；此外，使用ELISA检测法与LC/MS法可能导致定量差异，一些ELISA试剂盒已知与主要丁丙诺啡代谢物（包括丁丙诺啡-3-葡萄糖醛酸苷和去甲丁丙诺啡）交叉反应，可能由于假阳性检测夸大测量浓度。本研究使用LC/MS量化血浆和脑中的丁丙诺啡浓度，该方法具有更高分析特异性，使研究人员能区分丁丙诺啡与其结构相关代谢物丁丙诺啡-3-葡萄糖醛酸苷。
SC和MDA条件下血浆丁丙诺啡暴露的差异可能由吸收动力学的途径特异性差异和肠上皮细胞和肝细胞中药物代谢酶的首过代谢导致。与此一致，主要代谢物丁丙诺啡-3-葡萄糖醛酸苷的血浆水平在MDA递送后始终高于SC注射。为补偿口服递送后预期的首过代谢，通过MDA给药的丁丙诺啡剂量相对SC注射增加十倍，期望这种调整将使各给药途径的峰值血浆暴露相当。然而，这一期望仅部分满足，因为可比峰值血浆丁丙诺啡浓度仅在接受中间和高剂量丁丙诺啡的雌性C57BL/6 N小鼠中观察到，而在所有其他实验条件下MDA处理动物的最大血浆暴露显著较低。这些发现表明，除首过代谢外，其他机制有助于SC和MDA给药后不同的血浆分布。脑丁丙诺啡暴露数据支持此解释，显示尽管峰值血浆浓度未达到且血浆水平低于检测限，MDA递送后丁丙诺啡浓度显著更高。未来研究将需确定MDA递送后观察到的较高丁丙诺啡浓度是否与配方依赖性因素（如MDA载体高脂含量，含59%全脂（未脱脂）牛奶）有关。
虽然本研究是首个使用MDA方法给药卡洛芬和丁丙诺啡的研究，但先前研究已证明通过饮水、可食用递送载体（包括糖曲奇面团球、明胶糖果、加糖坚果酱和水凝胶递送系统）向实验啮齿动物口服镇痛给药的技术可行性和镇痛效能。然而，如通过笼内饮水提供物质的随意（ad libitum）口服递送方法的一个限制是由于个体饮水行为差异导致的剂量和时间变异性。相比之下，MDA方法对这些参数提供了更大控制，并使峰值血浆浓度更快速达到（至少对于以最小首过代谢为特征的物质）。此外，为MDA训练的动物保留记忆，即使治疗间隔数天仍继续可靠执行任务。因此，可在术前使用如加糖炼乳等载体使动物适应MDA，随后在术后期间使用相同方法给药镇痛药是可行的。
本研究有几个优势和局限性。一个显著优势是，对两种最常用镇痛药的分析是在不同小鼠品系和雄性与雌性动物中进行的。纳入品系和性别作为感兴趣变量很重要，因为这些因素对伤害感受处理和镇痛治疗反应有充分记录的影响。本研究的明显局限是未直接评估镇痛效能，也未检查已建立疼痛模型中的药代动力学特征或镇痛效应。因此，尽管数据提供了两种常用镇痛药相对于推荐血浆或脑阈值的血液和/或脑参考数据，但将这些发现外推至实际镇痛效能时应谨慎。关于MDA方法在疼痛管理中潜在应用的另一个转化考虑因素是，临床疼痛条件是否可能影响可口物质的摄入，从而降低基于MDA的镇痛药物递送的有效性。虽然在某些条件下可能如此，但术后疼痛不一定减少可口制剂的自愿消耗，表明伤害感受可能不固有地限制MDA方法的适用性。事实上，几项研究支持在显著伤害感受或损伤条件下可口物质的稳健自愿摄入。例如，在雄性C57BL/6小鼠大脑中动脉闭塞模型中，动物在卒中诱导后 readily消耗巧克力榛子酱中的丁丙诺啡；在部分坐骨神经结扎神经病理性疼痛模型中，小鼠维持含镇痛药（包括吗啡）的明胶制剂的稳定摄入，神经损伤后未减少；在雌性小鼠子宫内电穿孔研究中，含丁丙诺啡的颗粒消耗未减少，总食物消耗与对照组相比维持。总之，这些发现支持在急性和慢性疼痛条件下自愿摄入可口镇痛制剂的可行性，并与MDA方法即使在经历疼痛的动物中用于镇痛递送的适用性一致。此外，与通过饮水等其他非侵入性口服方法不同，MDA方法允许精确控制剂量和体积，能够确认每只动物的完全消耗。因此，如果动物不通过MDA自愿摄入镇痛溶液，仍可实现标准替代给药途径（如SC注射）以确保适当的镇痛递送。
另一值得未来研究澄清的方面是，疼痛相关炎症可能影响药代动力学参数（包括药物分布和血脑屏障通透性），从而可能影响中枢药物暴露。虽然这是重要考虑因素，但超出本研究范围，本研究专注于在非伤害感受基线条件下建立可靠自愿摄入以及系统和中枢暴露，作为疼痛模型后续验证的先决条件。
无论其适用性如何，MDA方法需要初始训练阶段，这与不需要训练阶段的给药程序相比增加了实验工作量。因此，在涉及大量动物队列或人员有限的研究中，MDA方法可能被视为不太实用。然而，研究人员强调，应结合其预期的动物程序改进来看待这一额外努力。认为增加的工作量本身不应成为反对实施有可能改善动物福利和减少与更具侵入性或厌恶性药物给药方法相关压力的方案的论据。因此，考虑到与MDA方法相关的潜在福利益处，研究人员认为初始训练要求代表合理且正当的权衡。这在涉及伤害感受或损伤的实验条件下尤其相关。在这种情况下，MDA方法的一个关键优势是减少约束的需要，特别是在术后恢复期间，动物可能带有植入物、导管或愈合切口。
总之，研究结果表明，MDA代表了一种精确有效的肠外注射替代方案，用于卡洛芬的系统递送，在性别和小鼠品系中实现了与SC给药相当的血浆暴露。同时，虽然支持通过MDA给药丁丙诺啡的技术可行性，但研究强调了口服阿片类药物递送的复杂性，以及除血浆浓度外考虑中枢药物暴露的重要性。总之，这些数据支持进一步开发MDA作为实验啮齿动物药物递送策略的有前景的改进（refinement），同时强调了未来研究整合药代动力学与行为和疼痛相关结果测量的必要性。
