糖原合成酶激酶-3（GSK-3）调控CD4+-CD8+协作以产生超武装细胞毒性T细胞用于肿瘤免疫治疗

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：GSK-3 regulates CD4-CD8 cooperation for super-armed CD8+ cytolytic T cells in immunotherapy against tumors

　　

尽管免疫检查点阻断（ICB）的疗效依赖于祖细胞与终末效应CD4+及CD8+T细胞区室的协同活性，但介导这种协作的细胞内在通路尚未被完全阐明。研究人员发现糖原合成酶激酶-3（GSK-3）是TCF-1+祖细胞及记忆CD8+T细胞分化的核心调控因子，其中GSK-3表达降低可增强抗病毒及抗肿瘤免疫。在GSK-3敲低（GSK-3 KD）小鼠中，GSK-3水平降低重塑了基础T细胞稳态，即使在无抗原刺激条件下也促使分化偏向记忆表型亚群。在慢性淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）Cl13感染期间，GSK-3 KD促进了GP33特异性记忆前体效应细胞（MPECs）的扩增与增殖。通过Seahorse及SCENITH进行的代谢分析显示，GSK-3 KD的TCF-1+干样CD8+T细胞中糖酵解及氧化磷酸化水平升高，同时GLUT1表达及线粒体质量增加，表明其代谢适应性增强。GSK-3也是调节性T细胞（Treg）抑制功能所必需的，且GSK-3抑制与表达降低可与PD-1阻断协同作用，使细胞毒性CD8+T细胞“超武装”，其特征是穿孔素及七种不同颗粒酶的上调。值得注意的是，野生型小鼠中B16-F10肿瘤的排斥依赖CD4+CTLA-4+Treg，而GSK-3 KD小鼠中的肿瘤控制则需要CD4+T细胞帮助以实现最佳颗粒酶诱导及肿瘤排斥。综上，这些发现定义了一个连接代谢与分化程序以调控T细胞命运及细胞毒性的GSK-3–PD-1信号轴，为克服ICB耐药提供了机制框架。

本研究发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》，针对免疫检查点阻断（ICB）疗效依赖CD4⁺与CD8⁺T细胞协同但调控机制不明、慢性感染及肿瘤微环境（TME）中T细胞耗竭导致治疗耐药的核心问题，探究糖原合成酶激酶-3（GSK-3）在T细胞命运决定、代谢重编程及CD4-CD8协作中的功能。研究人员通过构建T细胞特异性GSK-3敲低（GSK-3 KD）小鼠模型，结合慢性LCMV Cl13感染、黑色素瘤及结直肠癌荷瘤模型，联合流式细胞术、代谢分析、质谱流式（CyTOF）、转录组测序等技术，证实GSK-3是调控T细胞分化、代谢及功能的中心节点，其下调可通过增强CD4⁺T细胞帮助、削弱Treg抑制功能，与PD-1阻断协同诱导CD8⁺T细胞表达广谱颗粒酶，克服ICB耐药。该研究为改善肿瘤免疫治疗响应提供了新的靶点策略。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：1. 构建远端Lck启动子驱动Cre重组酶的T细胞特异性GSK-3α/β双 flox 敲低小鼠模型；2. 慢性LCMV Cl13及急性Armstrong感染模型评估抗病毒免疫应答；3. B16-F10黑色素瘤及MC38结直肠癌皮下荷瘤模型，联合GSK-3小分子抑制剂SB415286与PD-1阻断抗体治疗；4. 流式细胞术及质谱流式（CyTOF）解析T细胞亚群表型与肿瘤微环境免疫组成；5. Seahorse能量代谢分析与SCENITH单细胞代谢功能检测；6. 肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）批量RNA测序及生物信息学分析；7. 体外Treg抑制功能实验验证GSK-3在免疫调节中的作用。

研究结果部分如下：

GSK-3 KD小鼠显示T细胞记忆增加。在无抗原刺激的稳态下，GSK-3 KD小鼠外周CD8⁺T细胞显著减少初始表型，中枢记忆（T_CM）及效应记忆（T_EM）亚群扩增。慢性LCMV Cl13感染中，GSK-3 KD小鼠体重恢复更快、病毒载量更低，脾脏GP33特异性CD8⁺T细胞在第30天显著扩增，且偏向记忆前体效应细胞（MPECs）分化，短寿效应细胞（SLECs）及终末耗竭细胞减少。

GSK-3 KD促进CD8⁺T细胞中TCF-1表达。GSK-3 KD显著提升慢性感染第30天GP33⁺CD8⁺T细胞中TCF-1⁺祖细胞比例，且该表型在早期感染阶段已显现分化偏向。

GSK-3 KD CD8⁺T细胞显示耗竭减轻。GSK-3 KD小鼠中PD-1⁺TIM-3⁺耗竭细胞比例降低，TCF-1⁺干样祖细胞增加，且GP33⁺CD8⁺T细胞的IFN-γ、TNF-α分泌及颗粒酶B（GZMB）表达显著上调，功能耗竭得到逆转。

GSK-3作为T细胞代谢门控分子。体外低剂量TCR刺激下，GSK-3 KD T细胞增殖能力显著增强。Seahorse分析显示其糖酵解速率、糖酵解储备及线粒体呼吸水平均升高，SCENITH分析证实其兼具更强的糖酵解代偿与氧化磷酸化代偿能力，代谢灵活性增强。GSK-3 KD还特异性提升TCF-1⁺祖细胞亚群的GLUT1表达及线粒体质量。

GSK-3缺陷驱动线粒体生物量增加。GSK-3 KD使GP33⁺CD8⁺T细胞总线粒体质量升高，且在TCF-1⁺祖细胞、过渡耗竭及终末耗竭各分化阶段均显著增加。

GSK-3 KD增强PD-1阻断克服ICB肿瘤耐药的能力。在抗PD-1耐药的B16-F10 R1及MC38肿瘤模型中，GSK-3抑制剂SB415286与PD-1抗体联用显著抑制肿瘤生长，65%的小鼠产生治疗响应。CyTOF分析显示联合治疗扩增肿瘤内CD8⁺效应记忆T细胞（T_EM），并减少CD4⁺FOXP3^hiCD25⁺调节性T细胞（Treg）比例。

GSK-3 KD许可PD-1阻断诱导穿孔素及7/9种颗粒酶以增强CD8⁺CTL TILs。转录组测序显示联合治疗诱导910个独特差异基因，核心为协调上调穿孔素（Prf1）及7种鼠源颗粒酶（Gzmb、Gzmc、Gzmd、Gzme、Gzmf、Gzmg、Gzmk）。流式验证证实GSK-3 KD联合PD-1阻断显著提升肿瘤浸润CD8⁺T细胞中多颗粒酶的表达强度与阳性比例。

GSK-3调控Treg/Th平衡及CD4⁺T细胞帮助依赖性。GSK-3 KD使肿瘤微环境中CD4⁺FOXP3^-辅助T细胞比例升高，Treg比例下降，且体外实验证实GSK-3缺失严重损害Treg的抑制功能。CD4⁺T细胞清除实验显示，野生型小鼠中清除CD4⁺T细胞（主要为Treg）可使抗PD-1起效，而GSK-3 KD小鼠中清除CD4⁺T细胞则完全废除抗PD-1的疗效，伴随CD8⁺T细胞扩增受阻及多颗粒酶表达下调，表明GSK-3缺失使CD8⁺T细胞功能高度依赖CD4⁺T细胞帮助。

讨论部分总结：研究人员指出GSK-3是维持T细胞静息稳态的关键分子，其下调通过促进TCF-1⁺祖细胞与记忆亚群分化、增强代谢灵活性，逆转慢性感染中的T细胞耗竭。在肿瘤免疫中，GSK-3抑制与PD-1阻断协同重塑肿瘤微环境，减少Treg并扩增功能性CD8⁺T_EM细胞，首次发现单一分子调控可诱导CD8⁺T细胞表达7种颗粒酶的“超武装”状态。机制上，GSK-3通过调控CD4⁺T细胞亚群平衡决定治疗响应：野生型中Treg抑制占主导，GSK-3 KD后CD4⁺辅助功能成为CD8⁺效应维持的必需条件。该研究的遗传模型避免了既往小分子抑制剂的非特异性效应，明确了GSK-3在T细胞命运决定中的直接作用，与临床前及临床中GSK-3抑制剂增强CAR-T功能、改善老年T细胞活性的发现相呼应，为联合靶向GSK-3与ICB的临床转化提供了坚实的机制依据。