多价纳米抗体强效广谱中和金黄色葡萄球菌毒素

《Nature Communications》：Multivalent nanobodies for potent and broad neutralization of Staphylococcus aureus toxins

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是致死性菌血症和肺炎的主要诱因，其致病过程由 T 细胞超抗原（SAgs）和α-溶血素（Hla）等强效毒力因子驱动。尽管金黄色葡萄球菌的抗生素耐药率居高不下，但目前尚无可用疫苗或替代疗法。研究人员开发了一系列针对金黄色葡萄球菌感染关键毒素（包括 Hla 以及超抗原 SEB、SEC 和 TSST-1）的高效、高亲和力纳米抗体（Nbs）。通过冷冻电镜（cryo-EM）和 AlphaFold3 对临床混合疫苗诱导产生的这些纳米抗体进行综合分析，揭示了多样化的中和表位及机制，为免疫治疗和疫苗策略提供了见解。在这些发现的指导下，研究人员设计了稳定、多价且多功能的纳米抗体构建体。这些构建体包括一种可雾化吸入的三聚体纳米抗体，其对 Hla 和 SEC 具有增强的中和活性；以及一种十价纳米抗体 -IgG-Fc 融合构建体，其对金黄色葡萄球菌脓毒症中的多种主要毒素（SEB、SEC、TSST-1 和 Hla）表现出皮摩尔（pM）或更优的效价。这些多功能纳米抗体在肺炎和脓毒症小鼠模型中显示出保护作用，凸显了其作为应对金黄色葡萄球菌复杂毒力的多功能免疫疗法的潜力。该研究为超越现有治疗方案的精准免疫疗法奠定了基础，以对抗具有多种毒力机制的复杂细菌感染。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是全球细菌性感染的主要病原体之一，约占全球细菌感染的八分之一，并定植于 30% 至 50% 的健康人群体内。在免疫力低下、接受侵入性手术或组织屏障受损的患者中，金黄色葡萄球菌可引发包括医院获得性肺炎、脓毒症、骨髓炎和软组织感染在内的严重疾病。据近期全球估计，每年约有 110 万人死于金黄色葡萄球菌感染，主要死因为肺炎和血流感染。甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）的广泛出现加剧了治疗难度，因此被美国疾病控制与预防中心（CDC）列为“紧急威胁”，并被世界卫生组织（WHO）列为“高优先级”病原体。尽管疫苗和单克隆抗体（mAbs）被视为传统抗生素的潜在替代品，但针对金黄色葡萄球菌的此类疗法在临床试验中屡遭失败。现有疫苗诱导产生的抗体滴度保护持续时间短且 efficacy 有限，而单克隆抗体通常仅针对众多毒力因子中的一种，难以在临床上显现获益。这凸显了开发能够广泛且有效中和关键致病机制的替代策略的迫切需求。

T 细胞超抗原（SAgs）和α-溶血素（Hla）是驱动肺炎和脓毒症等严重感染的关键毒力因子。SAgs（如葡萄球菌肠毒素 B [SEB]、肠毒素 C [SEC] 和中毒性休克综合征毒素 -1 [TSST-1]）在许多临床分离株中表达，并与葡萄球菌中毒性休克综合征密切相关。SAgs 通过交联抗原呈递细胞上的 MHCII 分子与 T 细胞受体（TCR）Vβ结构域，强力刺激高达 30% 的 T 细胞，引发细胞因子风暴介导的休克，并破坏血管内皮完整性。Hla 是一种高度保守的成孔毒素，通过寡聚化形成七聚体孔道破坏宿主细胞膜，导致免疫细胞和上皮细胞损伤，促进细菌全身扩散及血栓性多器官损伤。鉴于当前疗法的局限性，基于驼科动物重链抗体抗原结合域（即纳米抗体，Nbs）的疗法因其分子量小（约 15 kDa）、特异性高、稳定性好及易于工程化改造等优势，成为极具潜力的新型抗体药物。然而，此前报道的针对金黄色葡萄球菌毒素的纳米抗体往往中和效力有限，且缺乏体内验证。

在此项发表于《Nature Communications》的研究中，研究人员报道了一系列针对金黄色葡萄球菌关键毒力因子（包括 SAgs 和 Hla）的高亲和力、强效中和纳米抗体的开发过程。通过结构表征揭示了多样化的表位和中和机制，并据此设计了能够同时靶向四种主要毒力因子的多价、稳定、可雾化且半衰期延长的纳米抗体构建体。研究结果表明，这些强效构建体在两种小鼠感染模型中均显示出显著的保护功效，确立了其作为应对复杂金黄色葡萄球菌感染的新型治疗平台的潜力。

研究人员开展此项研究主要采用了以下关键技术方法：首先，利用包含 SEB、SEC、TSST-1 和 Hla 突变体（类毒素）的临床研究用混合疫苗免疫羊驼，以诱导产生高质量抗体库。其次，采用基于质谱的蛋白质组学技术，结合自主研发的 AugurLlama 软件，从外周血单个核细胞（PBMC）来源的重链_only_抗体（hcAb）基因组数据库中鉴定并解卷积出数百种针对野生型毒素的纳米抗体 CDR3 序列。随后，利用冷冻电子显微镜（cryo-EM）解析纳米抗体与毒素复合物的高分辨率结构，并结合 AlphaFold3 计算建模预测其他纳米抗体的结合模式，从而阐明其中和机制及表位特征。最后，通过基因工程手段将筛选出的先导纳米抗体进行多价组装，构建了双特异性二聚体、三聚体以及与人 IgG1 Fc 片段（含 YTE 突变以延长半衰期）融合的十价构建体，并在人源化 MHCII 转基因小鼠脓毒症模型和野生型小鼠肺炎模型中评估其体内保护效力。

研究结果主要分为以下几个部分：
在抗超抗原纳米抗体库的发现与功能表征方面，研究人员从免疫羊驼中鉴定出针对 SEB、SEC 和 TSST-1 的多种纳米抗体。ELISA 结合实验显示这些抗体具有高亲和力，其中针对 SEB 的 B115、针对 SEC 的 C107 以及针对 TSST-1 的 T107 表现出最强的中和活性。功能实验表明，直接竞争 TCR 结合位点的纳米抗体其中和效力显著优于仅竞争 MHCII 位点或结合非受体区域的抗体。交叉反应性纳米抗体虽然能识别保守表位，但其中和效果往往不一致，提示针对特定功能表位的特异性靶向更为关键。

在纳米抗体中和机制的结构洞察方面，研究人员解析了 SEC 与两种强效纳米抗体（C107 和 C112）复合物的 3.1 ?冷冻电镜结构。结果显示，C107 直接结合于 SEC 的 TCR 结合界面，通过空间位阻阻断其与 TCR 的相互作用；而 C112 则结合于邻近 MHCII 结合位点的凹陷表位，通过立体冲突干扰 MHCII 的结合。AlphaFold3 模型进一步证实，针对 TCR 结合位点的纳米抗体普遍具有更一致且完全的中和效力。此外，对 26 种金黄色葡萄球菌超抗原的序列保守性分析发现，关键的 TCR 和 MHCII 结合位点保守性较低，这解释了为何针对保守表位的现有疫苗策略难以产生广谱保护性抗体。

在抗 Hla 纳米抗体的发现与表征方面，研究人员筛选出两个高亲和力先导纳米抗体 H204 和 H216。结构建模显示，H204 结合于 Hla 单体的β-三明治帽区，通过空间位阻阻碍 Hla 寡聚化为七聚体孔道；H216 则结合于 Hla 的茎区，锁定其非活性构象。两者均在红细胞溶血实验中表现出完全的中和保护活性。

在多价纳米抗体的工程化构建方面，基于结构指导，研究人员构建了针对 SEC 的双特异性二聚体（C112-C107）以及同时针对 SEC 和 Hla 的三价构建体（C112-C107-H204）。表面等离子体共振（SPR）和生物膜干涉（BLI）分析表明，多价化显著增强了结合亲和力（达到超高效力），其中三价构建体在体外实验中展现出皮摩尔级别的中和 potency，且具有良好的雾化稳定性。

在体内保护效力评估方面，三价纳米抗体 C112-C107-H204 在人源化 HLA-DR4 小鼠脓毒症模型中，显著减轻了由表达 SEC 和 Hla 的 MRSA 菌株引起的体重下降，并将肝脏细菌负荷降低了 15 倍。在野生型小鼠急性肺炎模型中，该构建体通过雾化给药显著改善了呼吸评分并减少了肺水肿，证实了其中和 Hla 和 SEC 的体内疗效。

为进一步扩展特异性，研究人员还构建了一种靶向 SEB、SEC、TSST-1 和 Hla 四种毒素的十价纳米抗体-Fc 融合蛋白。该构建体利用人 IgG1 Fc YTE 变体延长半衰期，并通过多价效应实现了飞摩尔至皮摩尔级别的超强中和效力，在体外实验中显示出对多种毒素及其临床菌株分泌物的广谱中和能力。

讨论部分总结指出，金黄色葡萄球菌利用多种外毒素协同作用导致严重感染并逃避免疫清除，而现有的抗生素和疫苗策略因耐药性、组织穿透力差或免疫印迹等问题效果有限。本研究开发的纳米抗体平台通过精准靶向关键毒力因子的功能性表位（特别是 TCR 结合位点），克服了传统疗法的局限。结构分析表明，现有疫苗策略所针对的保守表位并非最佳中和靶点，这为未来疫苗设计提供了重要修正方向。研究人员成功构建的多价纳米抗体不仅实现了对多种协同毒素的同时中和，展示了在脓毒症和肺炎模型中的确切疗效，还证明了该平台的高度模块化和可扩展性。通过调整组合不同的纳米抗体，可针对不同感染亚型或疾病阶段定制治疗方案。尽管目前的研究主要集中于预防性应用且受限于动物模型的预测性，但该成果为开发应对复杂细菌感染（包括其他具有多重毒力因子的病原体）的精准免疫疗法奠定了坚实基础，展现了广阔的临床转化前景。