《Nature Communications》：Hepatic SNHG9 links gut microbiota to liver protection in drug-induced liver injury
药物性肝损伤（Drug-Induced Liver Injury, DILI)是导致急性肝衰竭的主要原因之一，构成重大公共卫生负担。新兴证据强调肠道菌群作为关键环境因素深刻影响肝脏功能和DILI进展，但其潜在机制尚不清楚。本研究中，研究人员鉴定肝长链非编码RNA（Long Non-Coding RNA, lncRNA) SNHG9为连接肠道菌群与对乙酰氨基酚（Acetaminophen, APAP)诱导肝损伤的关键介导因子。肝SNHG9的上调通过激活MAS（一种G蛋白偶联受体，G Protein-Coupled Receptor, GPCR)来发挥抗肝毒性保护作用，该受体通过增强自噬（Autophagy)促进细胞损伤的清除。机制上，SNHG9与胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2（Insulin-Like Growth Factor 2 mRNA-Binding Protein 2, IMP2)结合，增强其与MYC mRNA的相互作用并抑制MYC翻译。由于MYC作为MAS1基因的转录抑制因子，这种抑制作用导致MAS表达上调。值得注意的是，肝SNHG9表达受肠道菌群调控，特别是通过代谢物2-羟基-2-甲基丁酸（2-Hydroxy-2-Methylbutyric Acid, HMB)。补充HMB或产HMB菌群可有效诱导肝SNHG9表达并减轻APAP诱导的肝损伤。这些发现揭示了一个此前未被认识的肠-肝轴，并为肠道菌群如何调控肝脏应激反应提供了机制性见解，提示了调控该通路在药物性肝损伤中的潜在应用前景。
药物性肝损伤（Drug-Induced Liver Injury, DILI)是临床面临的重大挑战，其中对乙酰氨基酚（Acetaminophen, APAP)过量是全球急性肝损伤的主要病因之一。APAP在体内经细胞色素CYP2E1代谢为毒性化合物N
苯醌亚胺（N-acetyl-p-benzoquinone imine, NAPQI)，后者通常通过与谷胱甘肽（Glutathione, GSH)结合形成无毒代谢物而解毒；但过量时，NAPQI过度产生耗尽GSH储备，触发线粒体氧化应激、内质网（Endoplasmic Reticulum, ER)应激、微循环障碍，最终导致肝细胞坏死。尽管具有重要临床意义，DILI的治疗手段仍十分有限。肠道菌群通过肠-肝轴在肝脏生理中发挥重要作用，菌群失调与DILI发病机制相关，菌群来源的代谢物如短链脂肪酸（Short-Chain Fatty Acids, SCFAs)、吲哚衍生物和次级胆汁酸等可调节肝脏功能，但将这些微生物信号转导为适应性肝脏响应的宿主分子介导因子仍不明确。
研究人员先前鉴定lncRNA SNHG9作为肠道中的关键宿主介导因子，响应微生物组成变化调控肠道脂质吸收和上皮细胞增殖。鉴于SNHG9亦在肝脏表达，研究人员探究了其在肠-肝通讯中的潜在作用及其在DILI发病机制中的参与。该研究发表于《Nature Communications》。
研究人员开展了一系列体内外实验，主要关键技术方法包括：利用不同动物设施来源的野生型C57BL/6小鼠进行肠道菌群16S rRNA测序分析及粪菌移植（Fecal Microbiota Transplantation, FMT)实验；构建肝脏特异性人SNHG9敲入小鼠（SNHG9
liver-KI)和腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV)介导的肝Snhg9敲低模型；采用CRISPR-Cas9基因组编辑技术构建SNHG9
?/? Huh7细胞系及SNHG9稳定过表达细胞；运用全转录组测序（RNA-seq)、RNA-蛋白下拉实验结合质谱分析、RNA免疫沉淀（RNA Immunoprecipitation, RIP)、微尺度热泳（Microscale Thermophoresis, MST)技术分析分子互作；利用荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization, FISH)、免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC)、免疫荧光（Immunofluorescence, IF)、透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM)进行组织学分析；并收集福建医科大学附属第一医院生物库的人DILI患者石蜡包埋肝活检样本、血清及粪便样本进行临床相关性验证。
**肝SNHG9减轻APAP诱导的肝损伤**
研究人员首先发现不同动物设施饲养的小鼠因基线肠道菌群谱不同而表现出肝Snhg9表达的显著差异，FMT实验证实菌群的因果调控作用。APAP攻击后，肝Snhg9呈现先降后升的双相动态模式，且Facility A来源小鼠始终维持更高Snhg9水平，提示菌群组成进一步调节其响应幅度。研究构建肝脏特异性人SNHG9敲入小鼠，APAP处理24小时后，SNHG9
liver-KI小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（Alanine Aminotransferase, ALT)和天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate Aminotransferase, AST)水平降低，肝坏死减少，Ly6G
+中性粒细胞和F4/80
+巨噬细胞浸润减少，TUNEL阳性凋亡细胞减少，促炎细胞因子肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factor Alpha, TNF-α)、白细胞介素6（Interleukin 6, IL-6)和白细胞介素1β（Interleukin 1 Beta, IL-1β)降低。重要的是，SNHG9不影响CYP2E1、CYP1A2表达及早期GSH耗竭与恢复，表明其不 altering APAP代谢激活阶段，而主要通过限制下游损伤放大和炎症反应发挥保护作用。AAV介导的Snhg9敲低则加重肝损伤，证实SNHG9的保护作用。临床样本分析显示DILI患者肝SNHG9表达高于健康对照，且SNHG9高表达组患者血清ALT、AST水平及坏死面积百分比更低，支持SNHG9升高作为代偿性肝保护反应的推测。
**SNHG9通过增强MAS介导的自噬减轻肝损伤**
通过RNA-seq筛选差异表达基因，研究人员发现SNHG9
liver-KI小鼠肝组织中Mas1显著上调，并经qPCR、蛋白质免疫印迹和IHC验证。MAS是已知的通过增强自噬保护APAP损伤的GPCR，涉及抑制蛋白激酶B（Protein Kinase B, AKT)活性、激活叉头框蛋白O1（Forkhead Box Protein O1, FOXO1)及其相关自噬通路。在SNHG9
?/? Huh7细胞中，MAS表达降低，AKT磷酸化增加，FOXO1乙酰化减少，巴弗洛霉素A1（Bafilomycin A1)追踪实验显示自噬流受损，自噬相关基因UNC-51样激酶1（UNC-51-Like Kinase 1, ULK1)、自噬相关7（Autophagy-Related 7, ATG7)和溶酶体相关膜蛋白1（Lysosomal-Associated Membrane Protein 1, LAMP1)下调；SNHG9再表达可恢复上述效应。SNHG9过表达Huh7细胞则呈现相反变化，且MAS受体拮抗剂A779可消除这些效应。体内验证显示，APAP攻击后SNHG9
liver-KI小鼠肝MAS
+细胞比例、Mas1表达、MAS蛋白及FOXO1乙酰化增高，AKT磷酸化降低，LC3-II升高而p62减少，ULK1、ATG7、LAMP1上调，TEM显示自噬小体增多；Snhg9敲低则呈现相反效应。DILI患者肝样本IF染色显示MAS水平升高，伴PINK1、PARKIN表达增高及LC3与线粒体标志物TOMM20共定位增强，支持线粒体自噬（Mitophagy)激活。
**SNHG9通过IMP2-MYC轴调控MAS表达**
为阐明SNHG9调控MAS表达的分子机制，研究人员通过RNA-蛋白下拉结合质谱鉴定IMP2为SNHG9强结合蛋白，RIP验证其直接相互作用。SNHG9二级结构预测显示四个潜在环区，缺失突变体分析确定环区3为IMP2结合位点。SNHG9过表达或敲除不影响IMP2蛋白水平。已知IMP2可结合mRNA调控其稳定性，公共数据分析显示IMP2可结合2,184种mRNA，其中包括MYC。SNHG9
liver-KI小鼠肝组织MYC mRNA降低。研究人员假设IMP2结合MYC mRNA促进其不稳定化并抑制翻译，而SNHG9增强该相互作用。实验证实IMP2与MYC mRNA直接互作，IMP2敲低增加MYC蛋白水平、增强MYC mRNA稳定性，而过表达则降低稳定性；SNHG9过表达增强IMP2与MYC mRNA结合，SNHG9-D3突变体无此效应。SNHG9
liver-KI小鼠APAP处理后肝MYC mRNA和蛋白降低，Snhg9敲低则增高。进一步研究显示MYC过表达降低MAS1 mRNA和蛋白，MYC敲低则增强；荧光素酶报告基因实验证实MYC直接抑制MAS1启动子活性，染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)-qPCR验证MYC直接结合MAS1启动子。MYC过表达可逆转SNHG9诱导的MAS表达、AKT-FOXO1信号及自噬流变化，原代小鼠肝细胞中亦观察到类似效应，表明SNHG9通过结合IMP2增强其与MYC mRNA互作，促进MYC mRNA不稳定化和翻译抑制，最终上调MAS转录和MAS介导的自噬。
**乳酸杆菌富集激活SNHG9-MAS信号并保护APAP诱导的肝损伤**
基于肝SNHG9对肠道菌群组成的敏感性，研究人员推测特定菌株补充可刺激肝SNHG9表达。16S测序比较分析鉴定Allobaculum、Faecalibaculum和乳酸杆菌属（Lactobacillus)为Facility A富集的优势菌属。口服灌胃实验显示仅植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum, L. plantarum)显著诱导肝Snhg9表达。APAP处理的L. plantarum预给药小鼠显示肝Snhg9、Mas1表达增高，MYC降低，MAS相关自噬信号增强（AKT磷酸化降低、FOXO1乙酰化增高、ULK1/ATG7/LAMP1上调、自噬流改善、TEM自噬小体增多)，功能上血清ALT/AST降低，肝坏死、炎症细胞浸润、凋亡及细胞因子减少，且不 altering CYP2E1/CYP1A2表达及早期GSH变化，但降低JNK磷酸化。
**乳酸杆菌通过代谢物HMB激活SNHG9-MAS信号**
研究人员进一步探究L. plantarum诱导肝SNHG9的机制。热灭活菌体无效而其培养上清可诱导Snhg9表达并降低血清ALT/AST，提示分泌型代谢物驱动该效应。准靶向代谢组学分析L. plantarum培养上清和门静脉血清，一致性富集代谢物为HMB、氢化肉桂酸（Hydrocinnamic Acid, HA)和苯乙醛酸（Phenylglyoxylic Acid, PA)，其中仅HMB有效上调Huh7细胞SNHG9表达。口服HMB可诱导肝Snhg9，降低ALT/AST、肝坏死、炎症浸润、凋亡和细胞因子，不 altering CYP2E1/CYP1A2和早期GSH，降低JNK磷酸化。AAV介导Snhg9敲低基本消除HMB的保护效应，恢复ALT/AST、坏死、炎症和凋亡，阻断HMB诱导的Myc抑制、Mas1上调及自噬信号激活。L. plantarum支链氨基酸转氨酶（Branched-Chain Amino Acid Transaminase, BCAT)表达和HMB产量显著高于其他菌株，Bcat基因敲除基本消除HMB产生，解释其他菌株效应缺失的原因。临床样本分析显示血清HMB浓度与DILI患者ALT、AST水平负相关。
研究人员进一步探讨HMB诱导SNHG9的受体机制。羟基羧酸受体2（Hydroxycarboxylic Acid Receptor 2, HCAR2)可识别烟酸及多种丁酸衍生物等代谢物，调节免疫反应和细胞生长。HMB与丁酸结构相似，研究人员假设其通过HCAR2激活SNHG9。Huh7细胞中HCAR2沉默显著削弱HMB诱导的SNHG9上调；cAMP反应元件（cAMP Response Element, CRE)-荧光素酶报告基因实验显示HMB减弱毛喉素（Forskolin)刺激的CRE驱动活性，符合HCAR2激活特征；MST分析证明HMB与GFP标记HCAR2直接结合，解离常数（Dissociation Constant, K
D)为66.7 ± 21.7 μM。体内验证显示HCAR2选择性抑制剂MPN共给药逆转HMB诱导的肝Snhg9、Myc、Mas1表达变化及下游自噬信号，消除HMB的保护效应（ALT/AST、坏死、炎症浸润、凋亡恢复至无HMB水平)。
**讨论部分总结与研究结论**
研究人员在讨论中指出，DILI尤其是APAP诱导的肝毒性仍是全球健康挑战，治疗手段有限。该研究通过鉴定肝SNHG9作为分子桥梁连接肠道菌群与肝脏保护，推进了对DILI中肠-肝通讯的理解。与SNHG9在肠道中通过SIRT1依赖性机制发挥作用不同，肝脏中SNHG9结合IMP2、抑制MYC翻译、上调MAS表达以激活自噬，这种IMP2-MYC-MAS调控轴的组织特异性差异凸显了SNHG9介导不同分子响应的能力。SNHG9与IMP2的互作为肝脏病理生理学中的转录后调控增添了新层次：IMP2传统上被视为RNA稳定因子和促肿瘤因子，但在SNHG9调控下于肝细胞中发挥破坏MYC mRNA稳定性的功能，这种双重性挑战了其传统致癌分类，为重新评估其在肝细胞癌中的治疗靶点价值开辟了新视角。MAS作为SNHG9在DILI中的下游效应器，其通过促进肝脏自噬清除损伤线粒体支持细胞恢复的作用得到强调；与既往关注细胞外配体如血管紧张素-(1-7)激活MAS不同，该研究揭示了通过转录后调控控制MAS表达的额外层面。
研究观察到肝SNHG9在APAP损伤中的动态调控规律：早期快速下调、恢复期渐进升高并最终超越基线，且肠道菌群组成影响其基线水平和诱导幅度，提示SNHG9作为肝毒性应激的固反馈机制被激活，而肠道菌群可进一步调节其表达。微生物来源的HMB激活该轴减轻APAP肝毒性的发现尤为重要：HMB作为已临床用于减轻肌肉消耗的白氨酸代谢物，在DILI中展示了此前未被认识的肝保护效应。L. plantarum中高表达HMB合成酶提示其可作为调控SNHG9通路的微生物来源，但HMB通过HCAR2激活SNHG9的精确分子机制尚待充分阐明。与其他主要影响APAP代谢或炎症的菌群-DILI互作机制相比，该通路作用于下游细胞应激响应水平，通过促进保护性自噬发挥作用，拓展了对菌群-DILI互作的理解。
尽管机制研究主要在小鼠模型中进行，但人DILI活检样本中较高肝SNHG9表达与较轻肝损伤的关联提示类似调控轴可能在患者中运作。研究人员审慎指出临床DILI病因多样，人类样本主要用于验证该通路激活在肝损伤中的存在而非直接模拟APAP毒性机制；个体差异如遗传背景、代谢状态、基础肝病和肠道菌群组成等因素均可影响肝损伤易感性和严重程度，而菌群组成差异可能影响内源性HMB产生，其他微生物代谢物或宿主代谢状态也可能通过平行信号通路调节SNHG9表达，这些因素共同影响HMB-SNHG9关联的强度。
研究结论部分指出，该研究鉴定了微生物-SNHG9-MAS信号轴对DILI中肠-肝通讯的贡献。研究表明微生物代谢物HMB通过HCAR2促进肝SNHG9表达，导致IMP2-MYC-MAS通路激活和肝细胞保护性自噬增强。这些发现揭示了微生物来源代谢物与lncRNA介导的肝脏应激反应调控之间的机制联系，为理解肠道菌群如何影响DILI易感性提供了深入见解。
