《Biochemistry and Biophysics Reports》：Deletion of TOP2B promoter using CRISPR-Cas9 induces senescence in HEK 293T cells
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DNA拓扑异构酶IIβ（TOP2B）在调控DNA拓扑结构、转录及基因组稳定性中发挥关键作用。尽管其在神经元、心肌细胞等有丝分裂后细胞中的功能已被广泛研究，但其在增殖细胞中的作用，尤其是与细胞衰老和衰老过程的关联仍不明确。现有证据表明，TOP2B表达随年龄增长而
DNA拓扑异构酶IIβ（TOP2B）在调控DNA拓扑结构、转录及基因组稳定性中发挥关键作用。尽管其在神经元、心肌细胞等有丝分裂后细胞中的功能已被广泛研究，但其在增殖细胞中的作用，尤其是与细胞衰老和衰老过程的关联仍不明确。现有证据表明，TOP2B表达随年龄增长而下降，并与多种年龄相关疾病有关，但其参与衰老的分子机制尚不清楚。本研究利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，特异性破坏HEK 293T细胞中TOP2B的启动子区域。该靶向区域位于?533至?481位点，包含NF–Y和SP1的结合基序，也是TOP2B启动子活性的主要组成部分。敲除该调控片段导致TOP2B表达显著下降。敲除细胞表现出典型的衰老特征，包括活性氧（ROS）水平升高、衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性增强，以及p53、p21和p16等关键标志物上调。为探究衰老的旁分泌效应，研究人员将来自TOP2B缺陷细胞的 conditioned media（条件培养基）施加于野生型HEK 293T细胞，这些细胞同样出现了衰老样表型。结果表明，TOP2B表达的缺失与分裂细胞中衰老样表型的诱导相关，并可向邻近细胞传播衰老信号。该研究揭示了TOP2B在调控细胞衰老中的一个此前未被充分认识的作用，为进一步理解其在增殖细胞类型中与年龄相关病理过程的潜在贡献提供了新视角。
本研究发表于《Biochemistry and Biophysics Reports》，围绕DNA拓扑异构酶IIβ（TOP2B）在增殖细胞衰老中的作用展开。此前研究多集中于有丝分裂后细胞，发现TOP2B表达随年龄下降并与神经退行性疾病、心脏功能衰退等相关，但在分裂细胞中其是否直接参与衰老调控尚不明确。鉴于TOP2B在DNA复制、修复及转录调控中的核心作用，研究人员推测其缺失可能引发增殖细胞的衰老反应，并通过旁分泌途径影响周围细胞。
关键技术方法包括：利用CRISPR-Cas9系统靶向删除HEK 293T细胞TOP2B启动子核心调控区（?533至?481），通过多对sgRNA实现精准片段切除；采用免疫荧光、蛋白质印迹（Western blot）、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测基因与蛋白表达变化；通过衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色、活性氧（ROS）检测评估衰老表型；利用条件培养基（CM）处理实验验证旁分泌效应；结合RNA测序（RNA-seq）分析差异表达基因及相关信号通路富集情况。
研究结果如下：
TOP2B启动子敲除降低HEK 293T细胞TOP2B表达并介导旁分泌抑制
CRISPR-Cas9靶向删除TOP2B启动子?533至?481区域后，细胞内TOP2B mRNA和蛋白水平随时间显著下降，96小时抑制最为明显。用敲除细胞的条件培养基（KO-CM）处理野生型HEK 293T细胞，同样导致受体细胞TOP2B表达下降，表明TOP2B缺失可通过分泌因子影响邻近细胞。
TOP2B缺失抑制细胞增殖、升高ROS并改变相关基因表达
单细胞克隆实验显示敲除细胞无法扩增，MTT及Ki-67免疫荧光证实增殖能力受损。ROS检测发现敲除细胞72小时和96小时氧化应激显著升高。同时，TOP2B启动子转录因子SP1表达逐渐下降，NF-Y表达波动，同源异构体TOP2A在早期短暂上调后下降，提示存在复杂的调控反馈与代偿机制。
TOP2B敲除细胞呈SA-β-Gal阳性并激活衰老相关基因及通路
SA-β-Gal染色显示敲除细胞72小时和96小时阳性率显著上升。RT-qPCR结果显示p16、p21、p53等细胞周期抑制基因表达随时间上调，抗凋亡基因BCL-2和FOXO4表达增加，符合衰老细胞的存活特征。RNA-seq分析显示p53信号通路、NF-κB信号通路、IL-17信号通路、MAPK信号通路及细胞因子-受体互作通路显著激活，而缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸降解等代谢通路下调。
KO-CM处理降低线粒体膜电位并增加ROS
线粒体膜电位探针Rhodamine 123染色显示，敲除细胞和KO-CM处理的细胞线粒体功能受损。KO-CM处理48小时即可引起受体细胞ROS显著升高，并抑制SP1和NF-Y表达，表明衰老信号可通过分泌组快速传递。
KO-CM处理降低Ki-67表达并增强SA-β-Gal活性
KO-CM处理细胞Ki-67表达下降，SA-β-Gal活性升高，重现了直接敲除TOP2B所见的衰老表型，进一步证明旁分泌因子足以诱导分裂细胞的生长停滞和衰老。
在讨论中，研究人员指出，以往TOP2B功能研究多集中于非分裂细胞，本研究首次在分裂细胞系中证实TOP2B缺失可直接诱导经典衰老表型，并揭示其通过旁分泌方式传播衰老信号。RNA-seq结果提示，TOP2B缺失可能通过p53、NF-κB、MAPK等通路触发细胞应激反应，并伴随线粒体功能障碍与代谢紊乱。研究同时承认，HEK 293T为转化细胞系，结果需在原代细胞中验证，且TOP2B是通过酶活性缺失还是转录调控功能参与衰老尚需进一步区分。
研究结论为：TOP2B是维持增殖细胞稳态的重要因子，其启动子缺失导致TOP2B表达沉默，引发不可逆的细胞周期阻滞、氧化应激升高、线粒体损伤及衰老相关分泌表型，并能通过旁分泌途径将衰老信号传递至周围细胞。这一发现拓展了TOP2B在衰老生物学中的功能认知，为理解年龄相关疾病的细胞机制提供了新的分子靶点。
