富血小板血浆预处理的骨髓间充质干细胞源性外泌体通过miR-29a-3p/PTEN/PI3K/Akt/mTOR轴抑制脊髓损伤后神经元凋亡与自噬并促进神经再生

《Journal of Molecular Histology》：Platelet-rich plasma-primed bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes inhibit neuronal apoptosis and autophagy, and promote nerve regeneration via the miR-29a-3p/PTEN/PI3K/Akt/mTOR axis after spinal cord injury

　　

富血小板血浆（PRP）和骨髓间充质干细胞（BMSCs）来源的外泌体均对脊髓损伤（SCI）具有治疗潜力，但两者联合应用尚未见报道。本研究旨在探究富血小板血浆预处理的骨髓间充质干细胞外泌体（PRP-BMSCs-EXO）是否具有更优的治疗效果及其分子机制。研究人员首先检测了PRP预处理对BMSCs增殖和外泌体分泌的影响；继而利用高通量测序和实时定量PCR（RT-qPCR）分析PRP-BMSCs-EXO与 naive BMSCs来源外泌体（BMSCs-EXO）的差异微小RNA（miRNA）表达谱；随后建立系列体外SCI模型评估PRP-BMSCs-EXO的治疗效应；通过TargetScan、RNAhybrid、基因本体论（GO）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）、双荧光素酶报告基因实验、RT-qPCR、蛋白质印迹法（WB）及挽救实验探究miRNA的作用及相关信号调控机制；最终通过体内SCI模型验证PRP-BMSCs-EXO的治疗效应与机制。结果显示，PRP预处理可促进BMSCs增殖和外泌体分泌；高通量测序和RT-qPCR揭示PRP-BMSCs-EXO中多种miRNAs高表达，其中miR-29a-3p最为丰富；体外SCI模型中PRP-BMSCs-EXO较BMSCs-EXO和PRP表现出更优的治疗效果。机制上，PRP-BMSCs-EXO可能通过递送miR-29a-3p增强嗜铬细胞瘤12（PC12）细胞的活力和迁移能力，抑制其凋亡和自噬，从而促进神经再生和SCI修复。生物信息学分析和荧光素酶实验表明PTEN可能是miR-29a-3p的下游靶基因；挽救实验证实miR-29a-3p/PTEN/PI₃K/Akt/mTOR轴可能介导PRP-BMSCs-EXO对SCI中神经元凋亡、自噬和神经再生的调控作用，且在体内SCI模型中得到进一步验证。综上，与PRP和BMSC来源外泌体单独应用相比，PRP预处理的BMSC来源外泌体对SCI具有更优的神经保护作用，其通过miR-29a-3p/PTEN/PI₃K/Akt/mTOR轴抑制神经元凋亡和自噬并促进神经再生，是一种有前景且有效的SCI治疗策略。

脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）是一种严重的中枢神经系统创伤，年发病率约为8.9–14.6/10万人，常由交通事故、高处坠落等暴力因素导致，可引起运动、感觉及自主功能障碍等永久性或进行性残疾，给患者、家庭及社会带来沉重经济负担。SCI的病理生理过程包括原发性损伤和继发性损伤：前者为外力所致的神经组织与血管初始机械性破坏；后者则由促炎细胞因子释放、活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）产生、趋化因子生成及补体系统激活等介导的级联反应所驱动，最终可导致脊髓屏障破坏、胶质瘢痕形成及局部微环境紊乱。目前尚无能够根本修复损伤神经组织或恢复脊髓功能丧失的治愈方法，因此亟需探索新型治疗策略。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）作为一种新兴治疗手段在SCI中展现出巨大潜力，但面临非定向分化、肺组织蓄积、致瘤性及免疫排斥等挑战。越来越多的证据表明，MSCs的治疗效应可能主要归因于其旁分泌活性，即通过释放营养因子抑制炎症、提供神经营养支持并促进神经再生，而非通过分化替代受损神经细胞。外泌体是含有核酸、脂质和蛋白质的纳米级内体囊泡，在细胞分化、信号转导、组织修复和再生中发挥关键作用。相较于干细胞，外泌体具有较低的致瘤性、更高的安全性、更好的稳定性、更长的半衰期、更小的直径以及更易穿透血脑屏障等优势，还可作为药物递送载体。MSCs来源的外泌体已被报道可发挥与其亲代细胞相似的抗炎、抗凋亡效应，促进神经血管化和轴突再生，修复损伤的脊髓组织结构。

富血小板血浆（platelet-rich plasma, PRP）是富含生长因子的血液浓缩物，包括血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）、胰岛素样生长因子-1（insulin-like growth factor-1, IGF-1）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）、表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）、神经生长因子（nerve growth factor, NGF）和脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）等，在组织再生、细胞增殖、血管生成和神经保护中发挥重要作用。研究表明PRP还含有多种miRNAs，如miRNA-21-3p、miRNA-155和miRNA-223等，且其miRNA含量较正常血浆更为丰富。

miRNAs是长度约22个核苷酸的短链非编码RNA，通过与靶信使RNA（mRNA）的3'-非翻译区（3'-UTR）结合，以mRNA降解或翻译抑制方式负向调控其表达。miRNAs参与调控细胞增殖与凋亡、促进血管生成、组织分化和组织再生等过程，并参与SCI后神经干细胞和祖细胞的增殖、迁移和分化等。鉴于其稳定性差、易被RNase水解，miRNAs需借助有效的载体系统进行递送，而外泌体凭借其磷脂双分子层膜可保护内部货物并将miRNAs安全递送至靶细胞。鉴于MSCs来源外泌体和PRP对SCI均有治疗效果但均无法完全治愈，联合多种方法可能提高疗效，因此本研究采用过氧化氢（H?O?, 300 μM)诱导PC12细胞损伤模拟体外SCI，并采用改良Allens法建立大鼠SCI模型，检测PRP-BMSCs-EXO、BMSCs-EXO和PRP对SCI后神经元凋亡、自噬和再生的影响，并探索其潜在分子机制。

研究结果显示，PRP预处理可增强BMSCs增殖活性，PRP-BMSCs-EXO的蛋白浓度显著高于BMSCs-EXO，提示PRP可能促进BMSCs释放外泌体。通过高通量miRNA测序，在PRP-BMSCs-EXO与BMSCs-EXO之间共鉴定出34个差异表达miRNAs（DE-miRNAs），其中20个上调、14个下调。经RT-qPCR验证，miR-29a-3p为PRP-BMSCs-EXO中最显著上调的miRNA。

在体内外SCI模型中，PRP-BMSCs-EXO较BMSCs-EXO和PRP单独应用表现出更优的治疗效应。体外H?O?诱导的PC12细胞损伤模型中，PRP-BMSCs-EXO显著增强神经元活力和迁移能力，减少TUNEL阳性凋亡神经元数量，增加NeuN阳性存活神经元和BrdU阳性新生神经元数量。蛋白质印迹法检测显示，PRP-BMSCs-EXO显著降低促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达，升高抗凋亡蛋白Bcl-2表达；同时降低自噬标志物Beclin-1表达和LC3B-II/LC3B-I比值，升高P62表达，表明其可抑制神经元自噬。体内大鼠SCI模型中，PRP-BMSCs-EXO治疗组的BBB（Basso, Beattie, and Bresnahan）运动功能评分和斜板试验角度显著高于其他治疗组；脊髓损伤部位组织结构改善最为显著，出血灶减少，神经元数量增加；TUNEL、BrdU和NeuN染色及蛋白质印迹法检测结果与体外实验一致。

机制研究方面，TargetScan和RNAhybrid预测并经双荧光素酶报告基因实验验证，PTEN（phosphatase and tensin homolog, 磷酸酶与张力蛋白同源物）为miR-29a-3p的直接靶基因。GO和KEGG富集分析显示靶基因与"脊髓发育"、"凋亡"和"自噬"等生物学过程相关。miRNA转染实验进一步证实，miR-29a-3p模拟物（mimic）组表现出与PRP-BMSCs-EXO处理相似的效应：增强细胞活力和迁移，抑制凋亡和自噬，促进神经元再生，下调PTEN表达，并激活PI₃K/Akt/mTOR信号通路（表现为p-PI₃K、p-Akt和p-mTOR表达升高）；而miR-29a-3p抑制剂（inhibitor）组则抑制上述效应。体内实验同样证实PRP-BMSCs-EXO通过miR-29a-3p/PTEN/PI₃K/Akt/mTOR轴发挥神经保护作用。活体成像显示DiI标记的外泌体可在SCI大鼠损伤部位聚集。

本研究采用的主要关键技术方法包括：从SD大鼠胫骨骨髓中分离培养BMSCs并通过流式细胞术及三系分化鉴定；采用两步离心法制备大鼠PRP；通过差速离心和超离心分离纯化BMSCs-EXO和PRP-BMSCs-EXO；运用透射电子显微镜（TEM）、纳米颗粒追踪分析（NTA）和蛋白质印迹法对外泌体进行鉴定表征；采用高通量miRNA测序结合RT-qPCR分析差异miRNA表达谱；建立H?O?诱导的PC12细胞体外损伤模型和大鼠Allen法SCI体内模型；应用CCK-8法、Transwell迁移实验和划痕愈合实验检测细胞活力与迁移；通过TUNEL染色、BrdU和NeuN免疫荧光染色评估神经元凋亡与再生；利用TargetScan和RNAhybrid进行靶基因预测，双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-mRNA靶向关系，并通过miRNA模拟物和抑制剂转染进行功能挽救实验；采用RT-qPCR和蛋白质印迹法检测miRNA、靶基因及通路蛋白表达；运用BBB评分和斜板试验进行大鼠运动功能评估；通过H&E染色进行脊髓组织病理学分析。

讨论部分，研究人员首先阐述了MSCs及外泌体在SCI治疗中的优势与挑战，强调PRP预处理可增强BMSCs增殖和外泌体分泌能力，并首次系统分析了PRP预处理对BMSCs外泌体miRNA表达谱的影响。关于细胞凋亡，研究指出PRP-BMSCs-EXO可通过调控Bcl-2家族、Bax和caspase家族等凋亡标志物显著抑制神经元凋亡。关于自噬，研究认为PRP-BMSCs-EXO通过降低Beclin-1表达和LC3B-II/LC3B-I比值、升高P62表达抑制自噬，从而产生神经保护作用，这与SCI后自噬的动态调控特性相符。研究进一步阐述miR-29a-3p通过靶向抑制PTEN，解除其对PI₃K/Akt/mTOR通路的负调控，激活该通路促进神经元存活、抑制凋亡和自噬、促进轴突再生。研究人员也客观指出研究的局限性：未探讨PRP预处理对BMSCs-EXO蛋白质组学的影响；仅分析了上调的DE-miRNAs，未涉及下调的DE-miRNAs及长链非编码RNA（lncRNAs）、环状RNA（circRNAs）等非编码RNA；以BCA蛋白浓度估算外泌体分泌量可能存在偏差。

研究结论指出：PRP预处理可促进BMSC增殖和外泌体分泌；与PRP和BMSCs-EXO相比，PRP预处理的BMSCs-EXO能更有效地促进SCI后的神经功能恢复；其机制可能涉及通过miR-29a-3p/PTEN/PI₃K/Akt/mTOR轴抑制神经元凋亡和自噬、促进神经元再生。这些发现可能为SCI的治疗提供新的见解。