《Molecular and Cellular Biochemistry》：Inhibition of the mitochondrial pyruvate carrier attenuates the integrated stress response activation in a cellular model of Huntington’s disease
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线粒体丙酮酸载体（mitochondrial pyruvate carrier, MPC）抑制在神经退行性疾病如阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）和帕金森病（Parkinson's disease, PD）模型中显示出保护作用。然而
线粒体丙酮酸载体（mitochondrial pyruvate carrier, MPC）抑制在神经退行性疾病如阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）和帕金森病（Parkinson's disease, PD）模型中显示出保护作用。然而，MPC作为亨廷顿病（Huntington's disease, HD）潜在治疗靶点的作用尚不清楚。HD是一种神经退行性疾病，其特征是促存活通路整合应激反应（integrated stress response, ISR）的失调。本研究旨在探究MPC抑制是否能够调节ISR并减轻细胞HD模型中突变型亨廷蛋白（mutant huntingtin, mut-Htt）的蛋白质毒性。研究人员用两种MPC抑制剂（mitoglitazone和UK5099）或溶剂对照处理表达野生型（wild-type, wt-）或mut-Htt N-末端片段的细胞。通过分析resazurin还原、氧消耗、胞外酸化和ATP水平评估代谢状态；通过蛋白质印迹（western-blot）和滤膜截留（filter-trap）实验评估ISR激活和亨廷蛋白蛋白质稳态。mut-Htt表达细胞表现出resazurin还原和ATP水平降低，以及eIF2α磷酸化增加，提示存在代谢应激和ISR激活。MPC抑制剂（100 μM）增加resazurin还原并降低呼吸作用，后者可被膜通透性甲基丙酮酸挽救，该物质可绕过MPC抑制。在wt-Htt表达细胞中，MPC抑制剂增加ATP和ISR标志物水平，提示代谢适应和ISR激活。在mut-Htt表达细胞中，MPC抑制剂维持ATP水平并减弱mut-Htt诱导的eIF2α磷酸化，但不改变可溶性或聚集性mut-Htt水平。该研究表明MPC抑制对ISR具有差异性调节作用：在对照细胞中激活ISR，在mut-Htt表达细胞中减弱过度激活的ISR。然而，MPC抑制不影响N-末端片段mut-Htt的蛋白质稳态。进一步研究需在严重程度较低的表达全长mut-Htt模型中探索MPC抑制，以更好地理解其在HD中的治疗潜力。
该项研究发表于《Molecular and Cellular Biochemistry》，旨在探究线粒体丙酮酸载体（MPC）抑制在亨廷顿病（HD）中的作用机制。神经退行性疾病是当前社会面临的重大挑战，但目前尚缺乏能够改变疾病进程的治疗方法。既往研究已将MPC确定为神经退行性疾病的潜在治疗靶点。MPC定位于线粒体内膜，介导丙酮酸向线粒体内的转运。药理学MPC抑制在PD动物模型中可促进多巴胺能神经元存活并改善运动功能，在AD患者中能够维持葡萄糖代谢率，在AD小鼠模型中星形胶质细胞特异性MPC1亚基缺失可减少淀粉样蛋白和tau蛋白聚集。MPC抑制通过减少线粒体丙酮酸输入，触发代谢重编程以维持三羧酸（tricarboxylic acid, TCA）循环，转而消耗谷氨酰胺、支链氨基酸和脂肪酸。然而，这些线粒体代谢变化与神经保护作用之间的机制联系尚不清楚。代谢变化如胞质氨基酸池耗竭可通过ISR激酶GCN2激活ISR，GCN2磷酸化真核起始因子2α（eukaryotic initiation factor 2 alpha, eIF2α），这是ISR通路的关键效应分子。磷酸化eIF2α（p-eIF2α）降低全局蛋白质合成，同时促进激活转录因子4（activating transcription factor 4, ATF4）和C/EBP同源蛋白（C/EBP-homologous protein, CHOP）等转录因子的选择性表达，这些转录因子调节氨基酸转运合成、自噬和细胞死亡通路。既往研究显示，MPC抑制在人类毛囊及前列腺癌和肺癌细胞模型中触发ISR激活，但在原代肝细胞和肌母细胞中可减弱内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激诱导剂毒胡萝卜素或衣霉素引起的ISR激活。
HD是由亨廷蛋白（huntingtin, Htt）中扩展的多谷氨酰胺（polyglutamine, polyQ）重复序列引起的单基因神经退行性疾病，该polyQ扩展增加mut-Htt发生蛋白水解、错误折叠和聚集的倾向。mut-Htt介导的毒性包括能量代谢受损、ER应激、蛋白质稳态（proteostasis）网络崩溃以及ISR失调。然而，MPC在HD病理生理学中的作用尚未被研究，其在HD中的治疗潜力亦未可知。ISR调节已显示出影响HD表型的潜力，ISR激活和抑制在HD中均具有保护作用。ISR激活可减少mut-Htt聚集并促进细胞存活，延长寿命并改善运动表现；反之，ISR抑制可减轻HD细胞模型中的毒性并改善记忆缺陷。鉴于上述背景，研究人员开展了本项研究，以探究MPC抑制是否能调节ISR激活并减轻HD细胞模型中mut-Htt的蛋白质毒性。
本研究中使用的主要关键技术方法包括：采用样本来源为Cambridge Enterprise的PC12细胞系，该细胞系具有多西环素诱导性表达N-末端片段人野生型（23个polyQ）或突变型（74个polyQ）Htt与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein, EGFP）融合蛋白的特性；采用Seahorse XF24细胞外通量分析仪进行线粒体呼吸测定；采用高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）进行ATP定量；采用蛋白质印迹和滤膜截留实验分别检测ISR标志物和Htt聚集；采用活细胞成像技术进行表型观察；采用resazurin还原实验和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放实验评估细胞代谢和细胞死亡。
研究结果部分，"Mitiglitazone和UK5099通过抑制MPC改变细胞代谢"：为评估MPC抑制在HD细胞模型中的作用，研究人员选择了MPC抑制剂mitoglitazone和UK5099。mut-Htt表达的诱导性PC12细胞与wt-Htt表达细胞相比，resazurin代谢降低。mitoglitazone和UK5099在高达100 μM浓度时对两种细胞均产生浓度依赖性resazurin代谢增加，但300 μM时降低resazurin代谢，提示细胞毒性。100 μM时两种MPC抑制剂均不显著改变mut-Htt表达细胞的LDH释放。线粒体氧消耗率（oxygen consumption rate, OCR）测定显示，100 μM mitoglitazone及10和100 μM UK5099均降低最大呼吸，该效应可被膜通透性丙酮酸类似物甲基丙酮酸（methyl pyruvate, MetPy）挽救，证实这些药物通过限制丙酮酸进入线粒体而发挥MPC抑制作用。
"MPC抑制剂减弱HD细胞模型中增加的ISR激活"：在未处理条件下，mut-Htt表达细胞与wt-Htt表达细胞相比，p-eIF2α水平增加但CHOP水平降低，提示mut-Htt表达诱导ISR激活但CHOP诱导受抑制。在wt-Htt表达细胞中，100 μM mitoglitazone显著增加p-eIF2α和CHOP水平，100 μM UK5099也有类似趋势。在mut-Htt表达细胞中，10和100 μM UK5099显著降低p-eIF2α，mitoglitazone也有降低趋势；但两种MPC抑制剂均不改变mut-Htt表达细胞中的CHOP水平。毒胡萝卜素处理可显著增加mut-Htt表达细胞中p-eIF2α和CHOP水平，证实这些细胞保留了对强效刺激诱导CHOP表达的能力。这些结果表明MPC抑制剂对ISR激活具有差异性效应：在wt-Htt表达细胞中激活ISR，在mut-Htt表达细胞中减弱mut-Htt诱导的ISR激活。
"MPC抑制剂不损害细胞ATP水平"：mut-Htt表达细胞ATP水平低于wt-Htt表达细胞，与resazurin代谢降低一致。鱼藤酮阳性对照降低细胞ATP水平。mitoglitazone显著增加mut-Htt表达细胞ATP水平并在wt-Htt表达细胞中呈增加趋势；UK5099仅显著增加wt-Htt表达细胞ATP水平，在mut-Htt表达细胞中维持ATP水平。非诱导PC12细胞的胞外酸化研究表明，100 μM UK5099增加培养基酸化，支持其对MPC的选择性，因单羧酸转运体抑制将减少乳酸输出从而阻止胞外酸化。
"MPC抑制剂不降低N-末端mut-Htt水平或细胞死亡"：活细胞成像显示mut-Htt表达形成聚集体。MG-132作为蛋白酶体抑制剂增加mut-Htt聚集，PERK激活剂CCT020312减少mut-Htt聚集，证实该HD细胞模型中mut-Htt蛋白质稳态可被药理学调节。然而，mitoglitazone或UK5099对mut-Htt聚集或可溶性Htt水平均无显著影响。尽管UK5099有效减弱mut-Htt表达细胞中的ISR激活，但与MG-132共处理时UK5099未能挽救增加的细胞死亡。
讨论部分，研究人员指出MPC抑制在PD和AD等神经退行性疾病模型中具有神经保护作用，但在HD尤其是mut-Htt蛋白质稳态方面的作用大多未被探索。本研究在表达N-末端mut-Htt片段的HD细胞模型中进行了研究，该模型呈现蛋白质毒性应激、代谢障碍和ISR过度激活。MPC抑制在wt-Htt表达细胞中激活ISR，这与人类毛囊及前列腺和肺癌细胞模型中的发现一致，可能由MPC抑制诱导的代谢重编程解释：减少线粒体丙酮酸输入并增加氨基酸分解代谢，导致胞质氨基酸池减少，激活ISR激酶GCN2。研究人员提出，MPC抑制通过将丙酮酸转向乳酸产生而消耗NADH而非产生NADH，可能降低mut-Htt表达细胞中升高的NADH/NAD
+比值，从而减弱ISR激活，但该机制需进一步研究验证。
关于mut-Htt蛋白质稳态，由于HD是由mut-Htt表达引起的单基因神经退行性疾病，是测试蛋白质稳态治疗策略的优良模型。然而，研究显示MPC抑制不改变N-末端mut-Htt的水平或聚集，也不减少MG-132共刺激下mut-Htt表达细胞的细胞死亡。研究人员认为不能排除更长MPC抑制剂处理时间可能获益的可能性，并建议测试其他更强效的MPC抑制剂如C7，以及在使用全长mut-Htt表达、疾病进展较慢的模型中进一步探索。
研究结论部分总结如下：旨在探究MPC抑制剂在ISR调节中的潜在保护作用，研究人员评估了MPC抑制后的ISR激活、代谢适应和mut-Htt蛋白质稳态。结果显示MPC抑制剂对ISR激活具有差异性调节作用：在wt-Htt存在条件下（对照条件）激活ISR，同时减弱mut-Htt诱导的ISR激活。然而，结果同时显示MPC抑制剂可能无法有效降低N-末端mut-Htt表达模型中的mut-Htt水平和聚集或阻止细胞死亡，该模型以快速且严重的疾病进展为特征。尽管如此，MPC抑制剂可能是精细调节ISR的潜在治疗策略，值得在表达全长mut-Htt、疾病进展较慢的模型中进一步研究。
