《Molecular and Cellular Biochemistry》：Single-cell transcriptomics reveals glycolytic heterogeneity and identifies STC2 as a key regulator of metabolic reprogramming in osteosarcoma
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骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）表现出深刻的代谢重编程，然而肿瘤微环境（TME）内特定细胞亚群及调控糖酵解（Glycolysis）的调节网络仍不清楚。研究人员整合了来自12例骨肉瘤样本的单个细胞RNA测序（scRNA-seq）数据与批量转录组学及高维
骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）表现出深刻的代谢重编程，然而肿瘤微环境（TME）内特定细胞亚群及调控糖酵解（Glycolysis）的调节网络仍不清楚。研究人员整合了来自12例骨肉瘤样本的单个细胞RNA测序（scRNA-seq）数据与批量转录组学及高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）。所识别的核心代谢调节因子在MG-63和U2OS细胞中通过功能实验和Seahorse细胞外通量分析进行了全面验证。研究人员的单细胞分析揭示了显著的代谢异质性，识别出一个表现为高糖酵解通量和干性特征的去分化“软骨母细胞样（Chondroblastic）”亚群。多组学筛选指出斯钙素-2（Stanniocalcin-2, STC2）是该表型的核心预后调节因子。体外验证表明，STC2敲低（Knockdown）显著抑制了骨肉瘤细胞的增殖、侵袭以及关键糖酵解酶（PGK1、LDHA和GLUT1）的表达。关键的是，细胞外通量分析显示STC2耗竭诱导了深刻的代谢转变，大幅减弱糖酵解（降低细胞外酸化率，ECAR）同时增强线粒体氧化磷酸化（提高氧消耗率，OCR）。研究人员展示了骨肉瘤的高分辨率单细胞代谢图谱，将STC2鉴定为糖酵解相关肿瘤进展的关键调节因子。靶向STC2有效逆转代谢重编程——将能量代谢从糖酵解转向氧化磷酸化——为骨肉瘤提供了一种有前景的治疗策略。
该研究论文发表在《Molecular and Cellular Biochemistry》。骨肉瘤（Osteosarcoma, OS）是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤，具有早期转移、快速进展和高基因组不稳定性等特征。尽管目前采用了新辅助化疗和手术切除相结合的多模式治疗策略，但过去三十年来，转移性或有复发疾病的患者的5年生存率仍停滞在约20%。改善临床结果的一个主要障碍是肿瘤内深刻的异质性和肿瘤微环境（TME）内复杂的相互作用，这助长了治疗抵抗和免疫逃逸。代谢重编程，特别是向有氧糖酵解（称为Warburg效应）的转变，是癌症的公认标志，支持快速细胞增殖和低氧条件下的存活。在肿瘤微环境背景下，升高的糖酵解活性使恶性细胞能够在葡萄糖竞争中胜过免疫细胞，导致免疫抑制微环境。然而，骨肉瘤组织由不同的细胞谱系组成，包括成骨细胞样、软骨母细胞样和成纤维细胞样亚型，混合了基质和免疫成分。传统的批量转录组分析平均了这些不同群体间的基因表达，掩盖了不同细胞亚群对整体代谢表型的特定贡献。单细胞RNA测序（scRNA-seq）已成为以空前分辨率剖析肿瘤微环境异质性的变革性工具。虽然最近的研究已经绘制了骨肉瘤的细胞图谱，但代谢可塑性与细胞分化状态之间的特定关联仍未得到充分探索。此外，阐明协调这些代谢转变的基因调节网络（GRNs）需要超越标准差异表达分析的先进计算方法。高维加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）提供了一个专门为稀疏单细胞数据优化的强大框架，能够识别与特定表型特征相关的功能基因模块和关键驱动基因（枢纽）。
基于此，研究人员提出了核心假说：在骨肉瘤高度异质的微环境中，存在一个具有异常糖酵解活性的独特细胞亚群，其通过特定的基因调节网络获得代谢和生存优势；此外，通过高分辨率多组学分析识别并靶向这些网络内的关键调节基因可以有效破坏骨肉瘤的代谢依赖性，从而抑制其恶性进展。在这项研究中，研究人员整合了scRNA-seq分析与批量转录组学和hdWGCNA，构建了骨肉瘤糖酵解异综合性的综合图谱。研究人员识别出一个具有高糖酵解通量且表现干性特征和广泛配体-受体相互作用的去分化软骨母细胞样细胞亚群。通过严格的筛选策略，研究人员指出STC2是连接糖酵解与肿瘤进展的核心调节基因。最后，研究人员通过在骨肉瘤细胞系中进行体外实验验证了STC2在促进糖酵解、增殖和侵袭中的功能作用，提供了一种潜在的治疗干预代谢漏洞。
为开展研究，研究人员主要用到了以下几个关键技术方法：首先，研究人员回顾性收集了公共数据集，包括来自基因表达综合数据库（GEO）的骨肉瘤单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集GSE152048（12例骨肉瘤样本）和批量转录组数据集GSE99671（18例骨肉瘤vs 18例正常样本）及GSE21257（生存分析），并从GTEx数据库获取生理骨组织表达数据，从CCLE获取细胞系表达数据。其次，使用Seurat R包进行scRNA-seq数据处理和质量控（QC），应用Harmony算法校正批次效应，使用UMAP降维和Louvain算法无监督聚类，并基于经典标记基因注释细胞类型，使用inferCNV区分恶性与非恶性细胞。第三，通过整合八种算法（AUCell、UCell、singscore、ssgsea、JASMINE、VAM、AddModuleScore和scSE）量化单细胞糖酵解活性，使用Monocle 2进行轨迹分析，使用CytoTRACE预测分化潜能。第四，应用hdWGCNA R包识别驱动糖酵解表型的基因共表达网络，选取软阈值幂为5构建无标度网络，识别基因模块并计算模块特征基因（MEs）。第五，进行功能富集分析（GO、KEGG、GSEA）和蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建（STRING、Cytoscape），使用CellChat进行细胞-细胞通讯分析。第六，进行体外实验验证：使用MG-63、U2OS和hFOB 1.19细胞系，通过慢病毒转染建立STC2稳定敲低细胞系，进行Western blot、qRT-PCR、集落形成实验、Transwell侵袭实验，并利用Seahorse XFe96分析仪进行线粒体压力测试（测OCR）和糖酵解压力测试（测ECAR）以评估代谢通量。
研究结果：
揭示骨肉瘤单细胞分辨率下的细胞景观和糖酵解异质性：研究人员分析了GSE152048数据集的scRNA-seq数据，严格质控后保留48,409个高质量细胞。应用Harmony算法有效减轻非生物技术变异。使用Seurat包无监督聚类识别出10个不同的细胞簇，并基于经典标记注释为10种主要细胞谱系：成骨细胞样（Osteoblastic）、软骨母细胞样（Chondroblastic）、破骨细胞（Osteoclast）、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）、成纤维细胞（Fibroblasts）、髓系细胞（Myeloid cells）、周细胞（Pericytes）、间充质干细胞（MSCs）、内皮细胞（Endothelial cells）和肌母细胞（Myoblasts）。使用inferCNV分析确认成骨细胞样和软骨母细胞样簇存在广泛的大尺度染色体拷贝数变异（CNVs），证实其恶性潜能。
高糖酵解亚群的识别和表征：为在单细胞水平稳健评估糖酵解活性，研究人员采用整合八种评分方法的多种算法策略。小提琴图、山脊图（Ridge plots）和UMAP可视化显示软骨母细胞样细胞表现出最高的代谢活性。聚焦软骨母细胞样群体，研究人员基于复合评分中位数将恶性细胞分为高糖酵解评分（HGS）和低糖酵解评分（LGS）亚组。HGS亚组显示出显著更高的CytoTRACE评分，表明高糖酵解与较少分化、干性样状态相关。轨迹分析突显了转录异质性，代谢通路富集分析确认HGS表型显著富集于“果糖-2,6-二磷酸代谢调节糖酵解”和“谷氨酸和谷氨酰胺代谢”。
通过hdWGCNA解析糖酵解相关基因模块：为识别驱动高糖酵解表型的基因调节网络，研究人员利用hdWGCNA。选取软阈值幂为5，层次聚类识别出12个不同的基因共表达模块，并通过将模块特征基因与糖酵解表型关联，识别出6个与HGS组强正相关的模块（黑色、红色、紫色、黄色、粉色和青色）。这些模块内的基因被指定为推定的高糖酵解表型相关基因。
整合筛选识别核心糖酵解调节因子：为查明驱动糖酵解程序的核心基因，研究人员采用多步交集策略。首先在scRNA-seq数据集中HGS与LGS组间差异表达分析识别1,765个显著上调基因；其次在独立批量RNA-seq数据集（GSE99671）中识别888个上调基因；最后与六个hdWGCNA模块相交得到30个核心糖酵解相关基因。功能富集分析确认这些基因参与糖酵解及相关代谢通路。
核心基因的预后意义和临床相关性：研究人员使用GSE21257队列的生存数据评估30个核心基因的临床相关性。单变量Cox回归分析识别出五个具有显著预后价值的基因：四个基因（ITGB3BP、STC2、NME1、UQCRH）与风险增加相关（风险比 > 1），而NDUFB11具有保护作用。Kaplan-Meier生存分析进一步证明这四个风险基因的高表达与较差的总生存期（OS）显著相关。
功能验证和机制探索：为探索四个核心分子的机制，研究人员检索了其顶部的200个共表达基因并进行KEGG通路分析，显示显著富集于代谢通路。PPI网络聚类表明代谢重编程是影响骨肉瘤进展的核心机制。使用GTEx骨组织数据的GSEA一致显示糖酵解相关信号通路富集。相关性分析显示这些核心基因与糖酵解通路关键组分显著正相关。
通过配体-受体相互作用进行微环境重塑：为研究高糖酵解软骨母细胞样细胞如何重塑肿瘤微环境，研究人员使用CellChat进行细胞-细胞通讯分析。HGS组表现出比LGS组显著更高的总体通讯强度，肌成纤维细胞是主要通讯者，HGS细胞在传入信号强度中排第3，在传出信号强度中排第5。通路特异性分析显示HGS细胞主要通过MIF、IL17和FGF信号通路进行传出通讯，同时优先通过IL17和IGFBP通路接收信号。配体-受体对分析强调HGS细胞作为配体显著上调了如SEMA3D-(NRP2 + PLXNA3)和SEMA3D-(NRP2 + PLXNA2)的相互作用。
STC2功能和下游信号通路的体外实验验证：为严谨验证生物信息学挖掘识别的核心靶点，研究人员选择STC2进行进一步体外实验佐证。Western blot分析确认STC2蛋白水平在骨肉瘤细胞系（MG-63）中较永生化成骨细胞系（hFOB 1.19）显著升高。设计并评估靶向STC2的五个短发夹RNA（shRNAs），选择敲低效率最高的shRNA#1和shRNA#2建立稳定敲低细胞系。功能上，集落形成实验显示STC2耗竭显著抑制骨肉瘤细胞增殖能力；Transwell侵袭实验显示STC2敲低后侵袭潜能明显降低。Western blot分析显示STC2敲低导致关键糖酵解酶（PGK1、LDHA和GLUT1）同步下调。
STC2敲低诱导MG-63骨肉瘤细胞代谢向氧化磷酸化转变：为全面描述基因敲低对细胞能量代谢的影响，研究人员使用细胞外通量分析系统评估线粒体和糖酵解功能。线粒体压力测试显示基因敲低显著增强整体线粒体氧化磷酸化，基础呼吸、ATP产生、最大呼吸能力在敲低组中均升高，备用呼吸容量在无变化或在高敲低组中增加。糖酵解压力测试显示基因敲低深刻抑制糖酵解代谢，糖酵解（葡萄糖注射后ECAR增加）、糖酵解能力、糖酵解储备均降低。总之，基因敲低诱导了深刻的代谢转变，基本特征是线粒体氧化磷酸化上调同时糖酵解活性伴随减弱。
讨论部分总结：骨肉瘤由于深刻的肿瘤内异质性和早期转移倾向仍是临床挑战。虽然代谢重编程是恶性的公认标志，但骨肉瘤生态系统中驱动糖酵解的精确细胞背景和调节网络仍不清楚。该研究整合单细胞转录组学与大维度网络分析以剖析骨肉瘤代谢景观，提供了三个主要见解：识别出去分化、高糖酵解软骨母细胞样亚群；描绘驱动此表型的独特基因调节网络；验证STC2作为连接干性与肿瘤侵袭性的关键代谢调节因子。单细胞分析揭示软骨母细胞样簇是骨肉瘤的代谢中心，挑战了糖酵解在肿块肿瘤中均匀升高的普遍假设，表明代谢活性高度异质且内在联系于细胞分化状态。高糖酵解评分与高CytoTRACE评分强相关，表明骨肉瘤中有氧糖酵解不仅是生存适应，而且是干性、去分化状态的基本属性。应用hdWGCNA超越差异表达识别驱动高糖酵解表型的基因模块，通过将这些模块与批量转录组数据相交，指出STC2为核心调节因子。虽然在癌中STC2已被认为参与缺氧反应，该研究确立了其在骨肉瘤代谢重编程中的具体作用。体外验证确认STC2沉默同时下调限速酶PGK1、LDHA和GLUT1，导致增殖和侵袭受抑，表明STC2可能作为上游主开关协调多个糖酵解基因的表达。CellChat分析进一步表明STC2高、高糖酵解细胞通过MIF和IL17信号轴主动与肿瘤微环境互动，意味着双重角色：通过糖酵解维持自身生长，同时调节免疫微环境。功能实验表明STC2敲低将代谢依赖从糖酵解转向氧化磷酸化，MG-63细胞STC2耗竭显示线粒体呼吸和ATP产生增加，同时糖酵解通量抑制。该研究存在一定局限性：scRNA-seq队列样本量相对较小；体外功能实验主要依赖经典骨肉瘤细胞系，可能未完全代表骨肉瘤固有异质性；STC2驱动代谢重编程的精确分子级联需更深机制探索，如是否通过STC2-PI3K/AKT-HIF-1α代谢级联。据研究人员所知，该研究提出了首个专门绘制骨肉瘤微环境内糖酵解异质性的高分辨率单细胞图谱。通过整合scRNA-seq与hdWGCNA，不仅解析了不同细胞谱系的复杂代谢可塑性，还指出STC2作为稳健核心调节基因。从临床转化角度，识别STC2提供双重价值：作为风险分层的预后生物标志物，并突出新的治疗漏洞。靶向STC2或其下游代谢效应物可提供一种有前景的策略来破坏骨肉瘤的代谢依赖性，最终克服代谢介导的肿瘤进展并改善患者结果。总之，该研究提供了骨肉瘤代谢的全面单细胞分辨率图谱，揭示干性、高糖酵解软骨母细胞样亚群作为肿瘤侵袭性的中心驱动因素。证明STC2作为此代谢程序的主调节因子，将增强糖酵解与增殖、侵袭和代谢可塑性联系起来。靶向STC2或其下游糖酵解效应物代表了一种有前景的治疗策略，可破坏最具侵袭性肿瘤克隆的能量供应，并可能重塑免疫抑制肿瘤微环境，为克服骨肉瘤治疗抵抗提供新途径。
