《Acta Neuropathologica》：The phosphoproteomic landscape of the neurological manifestations in tuberous sclerosis complex
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结节性硬化症复合体（tuberous sclerosis complex，TSC）是一种由TSC1和TSC2突变引起的罕见疾病，导致雷帕霉素机制靶蛋白复合体1（mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1）激
结节性硬化症复合体（tuberous sclerosis complex，TSC）是一种由TSC1和TSC2突变引起的罕见疾病，导致雷帕霉素机制靶蛋白复合体1（mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1）激活。TSC患者的神经系统表现包括癫痫、自闭症和智力障碍。两类脑部病变——皮质结节（cortical tubers）和室管膜下巨细胞星形细胞瘤（subependymal giant cell astrocytomas，SEGAs）——导致了TSC中大多数神经系统表现。当前对于结节和SEGA中发生的分子改变及其如何促进疾病发病机制的认识仍然有限。为探究这一问题，研究人员对TSC患者的结节和SEGA组织进行了蛋白质组学（proteomics）与磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）分析。
结节显示出线粒体呼吸、细胞骨架组织以及神经元功能发生改变的证据。然而，研究人员未能在结节中检测到mTORC1激活，这很可能是由于其中TSC1或TSC2完全失活的细胞数量较少。相比之下，SEGA显示出强烈的mTORC1激活以及蛋白质组和磷酸化蛋白质组的大规模变化。SEGA表现出核糖体蛋白表达升高以及神经炎症反应激活。磷酸化蛋白质组学在SEGA中鉴定到2154种蛋白内增加的6060个磷酸化位点（phosphosites）。SEGA中多种参与RNA代谢（RNA-metabolism）的蛋白——包括参与mRNA剪接（mRNA splicing）的蛋白——其磷酸化水平升高。与此一致，研究人员发现SEGA组织中存在广泛的mRNA转录本剪接改变，且这种改变与多种癌症共享。这些数据极大扩展了人脑中已知mTORC1靶蛋白的范围，并揭示mRNA剪接的大规模错误调控可能促进TSC中SEGA的形成。
该研究发表于《Acta Neuropathologica》，聚焦于结节性硬化症复合体（tuberous sclerosis complex，TSC）脑病变的分子病理基础，尤其是皮质结节（cortical tubers）与室管膜下巨细胞星形细胞瘤（subependymal giant cell astrocytomas，SEGAs）所对应的蛋白质组与磷酸化调控图谱。TSC是一种由TSC1或TSC2失活突变所致的常染色体显性遗传病，其核心致病机制是TSC蛋白复合体功能受损后，雷帕霉素机制靶蛋白复合体1（mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1）持续过度激活。临床上，TSC的神经系统损害最具致残性，常表现为婴儿痉挛、难治性癫痫、自闭症谱系障碍、智力障碍及其他TSC相关神经精神障碍。尽管既往研究已经证明TSC脑病变与mTOR通路异常密切相关，但对于结节与SEGA内部具体发生了哪些蛋白表达改变、哪些底物发生异常磷酸化，以及这些改变如何共同推动病变形成与进展，仍缺乏系统性的直接证据。因此，开展面向人类病灶组织的无偏倚蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学研究，对于澄清TSC神经病理机制并寻找潜在治疗靶点具有重要意义。
本研究围绕这一问题，系统分析了TSC患者手术切除的结节与SEGA组织，并与两类对照样本进行比较：一类为年龄匹配的尸检脑组织（postmortem，PM），另一类为颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy，TLE）手术组织。研究结果显示，结节与SEGA虽然同属TSC相关脑病变，但其分子层面改变具有显著差异。结节主要表现为线粒体呼吸相关蛋白下降、细胞骨架组织与神经元功能相关磷酸化异常，但整体上未检测到明确的mTORC1激活信号。相反，SEGA则表现出TSC1/TSC2表达大幅下降、经典mTORC1底物显著高磷酸化、核糖体生物发生增强、炎症相关蛋白上调，以及RNA代谢和mRNA剪接调控网络的系统性失衡。尤其重要的是，研究人员在SEGA中鉴定出大量新增的候选mTORC1靶蛋白，并进一步结合既往RNA测序（RNA-seq）数据证明，SEGA存在广泛的可变剪接异常，且其异常剪接谱与多种肿瘤共享。由此，论文提出TSC中SEGA的病理形成不仅与mTORC1驱动的蛋白合成增强有关，也与RNA加工和剪接程序的大规模扰动密切相关。
研究人员采用的关键技术方法主要包括：基于串联质谱标签（tandem mass tag，TMT）标记的定量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学，对TSC患者新鲜冻存结节组织和SEGA组织进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测，并结合顺序金属氧化物亲和色谱（SMOAC）进行磷酸肽富集；使用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶双酶切提高SEGA磷酸化位点覆盖度；利用基因本体（gene ontology，GO）和Reactome进行功能富集分析；对既往发表的SEGA RNA-seq队列（17例SEGA、8例脑室周围对照组织）进行转录本、剪接事件和外显子层面的再分析；并结合TSC1/TSC2靶向测序与杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）分析评估遗传背景。样本来源包括Tuberous Sclerosis Alliance Biosample Repository、London Neurodegenerative Diseases brain bank和NIH Neurobiobank。
TSC patient clinical and genetic characteristics
研究首先描述了纳入样本的临床与遗传学特征。结节样本来自6例TSC患者，均存在癫痫，其中3例伴自闭症；遗传学上，5例携带致病性TSC2胚系变异，1例为意义未明TSC2变异。SEGA样本来自5例TSC患者，4例完成遗传分析且均存在致病性TSC2胚系变异，其中2例检测到TSC2的LOH。对照包括6例TLE手术组织以及8例年龄匹配的PM皮质组织。该部分为后续蛋白质组和磷酸化蛋白质组比较提供了临床和分子基础，也解释了SEGA更可能存在双等位基因失活，从而具备更强的mTORC1激活背景。
Proteomics indicates mitochondrial respiration processes are decreased in tubers
在结节的总蛋白质组分析中，研究人员检测到6058种蛋白。与PM或TLE对照比较后发现，结节中差异蛋白数量有限，且共同差异蛋白中以下调为主。GO分析显示，下调蛋白显著富集于氧化磷酸化、有氧呼吸、电子传递链等线粒体相关生物过程，提示结节组织存在明显的线粒体呼吸功能受损信号。与此同时，TSC1与TSC2蛋白表达仅轻度下降，其中TSC2下降更为明显，但总体幅度仍然较小。该结果表明，结节的主要特征并非大规模蛋白重编程，而是以能量代谢，特别是线粒体相关过程受损为代表的相对温和改变。
Phosphoproteomics indicates changes in cytoskeleton organisation and neuronal function in tuber tissue
结节磷酸化蛋白质组学共检测到17475条磷酸肽。功能富集分析显示，磷酸化升高的蛋白主要与细胞骨架组织、肌动蛋白丝相关过程有关，而磷酸化降低的蛋白则富集于神经递质转运、突触小泡循环、突触小泡膜等神经元功能通路。该结果说明，结节组织中细胞结构重塑相关信号增强，而突触传递与神经元成熟功能相关过程相对受抑。这与结节作为皮层发育异常病灶的组织学特征相吻合，也提示结节相关神经功能障碍可能与突触机制减弱有关。
Phosphoproteomics shows no mTORC1 activation in tuber tissue
尽管TSC的核心机制是mTORC1过度激活，但在结节中，研究人员并未通过磷酸化蛋白质组学获得这一通路被整体激活的有力证据。经典mTORC1底物4E-BP1、4E-BP2和RPS6的总蛋白表达并无明显升高，其关键磷酸化位点也未见一致性上调；进一步与已报道的57类直接mTORC1底物位点比对，也未发现同时相对两类对照均显著升高的位点。论文据此认为，结节组织中尽管存在少量TSC1/TSC2双等位基因失活细胞，但在整体匀浆水平上其比例可能过低，从而难以产生可被群体蛋白质组学检测到的mTORC1磷酸化特征。这一结论也解释了为什么结节与SEGA在分子图谱上存在显著差异。
TSC1 and TSC2 expression are strongly reduced in SEGA tissue
与结节不同，SEGA的总蛋白质组学显示出更为剧烈的分子改变。采用胰蛋白酶条件时，研究人员检测到6304种蛋白，主成分分析显示SEGA与两类对照明确分离。TSC1和TSC2蛋白表达在SEGA中分别显著下降，蛋白拷贝数分析也支持这一结果，提示SEGA中有更多细胞发生TSC复合体功能丧失。与此同时，mTORC1下游靶蛋白4E-BP2和RPS6的总蛋白水平升高。既往报道的SEGA标志蛋白ANXA1、GPNMB、S100A11在本研究中亦显著升高，而神经系统发育相关蛋白NPTX1显著下降。这说明SEGA不仅具有鲜明的TSC通路异常，而且其蛋白表达谱与既往转录组研究高度一致，验证了数据可靠性。
Proteomic analysis shows SEGA tissue exhibits increased ribosomal biogenesis and an inflammatory response
GO分析进一步表明，SEGA中上调蛋白最显著地富集于细胞质翻译和核糖体相关通路。大量大、小亚基核糖体蛋白表达增加，提示mTORC1驱动的蛋白质合成能力增强。与此同时，抗原加工与呈递相关通路也显著富集，多种主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）蛋白显著上调，包括HLA-G和HLA-DRB5。该结果说明SEGA除合成代谢增强外，还伴随显著的神经炎症反应。相对地，下调蛋白则主要集中于突触传递、突触前与突触后结构等神经元相关类别，这也反映出SEGA组织成分与正常皮质或TLE组织存在明显差异。
Phosphoproteomics detects activation of mTORC1 signalling in SEGA tissue
SEGA磷酸化蛋白质组学在胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶条件下分别检测到24861条和12248条磷酸肽，主成分分析提示SEGA与对照高度分离。与结节相反，SEGA中经典mTORC1底物发生了明确而广泛的高磷酸化：4E-BP1在T37、T46、S65、T70位点以及4E-BP2在S65位点磷酸化升高，RPS6在S235、S244等位点磷酸化增加，STAT3 Y705磷酸化亦显著增强。进一步将SEGA上调位点与既往报道的直接mTORC1底物进行比较，发现57个底物中的40个位点在SEGA中显著升高，强有力地证实了SEGA存在mTORC1信号激活。基于统计阈值，研究人员最终筛选出SEGA中增加的6060个磷酸化位点，涉及2154种蛋白，这一数据集显著扩展了人脑中潜在mTORC1靶标的谱系。
Phosphorylation of RNA metabolism proteins is increased in SEGAs
对SEGA中磷酸化升高蛋白的功能分析显示，最突出的富集类别并非单纯的蛋白翻译，而是RNA代谢、RNA加工与RNA结合。Reactome分析进一步指出，加帽含内含子前体mRNA加工、RNA代谢以及mRNA剪接等通路显著富集。大量剪接相关蛋白发生磷酸化升高，包括U2相关剪接体组分、前体mRNA加工因子、SR相关蛋白、外显子连接复合体蛋白，以及16种异质核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，hnRNPs）。其中部分hnRNP的功能性磷酸化位点此前已被证实可调控其活性，提示SEGA中mTORC1激活并非仅促进翻译，而是系统性重塑RNA剪接调控网络。这一发现是本文最重要的机制性推进之一。
Evidence of widespread changes to splicing in SEGAs
为验证上述磷酸化改变是否对应真实的转录后剪接异常，研究人员分析了既往发表的SEGA RNA-seq数据。结果显示，无论在转录本异构体转换、特定剪接事件还是差异外显子使用层面，SEGA均存在广泛异常。IsoformSwitchAnalyzeR鉴定到3139个显著异构体转换，rMATS识别出1572个显著剪接事件，DEXSeq分析发现3817个基因存在差异外显子使用。三种方法之间存在显著交集，且被多方法重复验证的异常剪接基因显著富集于RNA处理和RNA剪接通路。尤其值得注意的是，多个hnRNP自身的mRNA也发生了剪接改变，提示SEGA中存在一种“剪接调控因子被异常磷酸化，同时其自身转录本又发生异常剪接”的多层级失衡状态。
SEGA-associated splicing changes show convergence with cancer-associated splicing programmes
研究人员进一步将SEGA的异常剪接基因集与ASCancer Atlas中人工整理的癌症相关异常剪接事件进行比较，发现两者存在明确重叠。无论采用两种方法还是三种方法共同验证的SEGA异常剪接基因，与癌症相关剪接数据库均有一定比例交叉。共同基因富集于mRNA剪接调控、细胞骨架与增殖相关通路，且包含多种剪接调控因子、肿瘤相关信号分子以及细胞黏附和极性维持基因。这说明SEGA中的异常剪接程序并非孤立现象，而是与更广泛的肿瘤相关剪接失调谱存在趋同，为理解SEGA的肿瘤样生物学特征提供了新的分子证据。
讨论与研究结论解读
论文讨论部分强调，本研究通过定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学，对TSC患者脑病灶进行了深度分子表型描绘。结节与SEGA均与TSC相关，但两者在分子病理上明显不同：结节主要体现为线粒体呼吸、细胞骨架与神经元功能方面的改变，而SEGA则呈现更强烈、更广泛的TSC1/TSC2缺失相关效应和mTORC1激活特征。研究还指出，结节中未检测到明确mTORC1激活，并不否定局部细胞层面的异常，而更可能反映病灶中双等位基因失活细胞占比有限，整体组织匀浆分析被稀释。相反，SEGA由于更多细胞具有TSC2 LOH或等效的双等位失活，因此其mTORC1激活信号在蛋白质组层面清晰可见。
研究结论可概括为：TSC患者SEGA中存在显著的mTORC1依赖性磷酸化重编程，研究人员据此鉴定了大量潜在的新型mTORC1靶蛋白；这些异常磷酸化事件尤其集中于RNA代谢和mRNA剪接调控蛋白，并与SEGA组织中大规模异常剪接相一致；SEGA异常剪接谱与多种癌症存在部分共享，提示剪接失调可能是推动SEGA形成的重要病理机制。总体而言，该研究显著扩展了人脑中mTORC1下游靶标的已知范围，揭示了RNA加工与剪接失衡在TSC相关SEGA中的关键作用，并为未来基于剪接调控或mTORC1下游新靶点的治疗策略提供了重要理论基础。
