《Biomarker Research》：Plasmatic CXCL13 as a biomarker of primary resistance to immunotherapy and impaired peripheral immunity in non-small cell lung cancer
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背景：免疫治疗（IO）改善了非小细胞肺癌（NSCLC）的预后，然而部分患者经历免疫治疗原发耐药（PIR）。由于CXCL13在抗肿瘤免疫反应中的作用，其可能是一个有前景的PIR生物标志物。方法：研究纳入了来自西班牙15个中心的观察性、多中心、真实世界研究BLI-
背景：免疫治疗（IO）改善了非小细胞肺癌（NSCLC）的预后，然而部分患者经历免疫治疗原发耐药（PIR）。由于CXCL13在抗肿瘤免疫反应中的作用，其可能是一个有前景的PIR生物标志物。方法：研究纳入了来自西班牙15个中心的观察性、多中心、真实世界研究BLI-O的177例接受IO的IV期NSCLC患者。在158份基线（BS1）和98份IO首个周期后（BS2）血浆样本中测量了CXCL13及其他39种细胞因子。此外，确定了BS2外周T和B细胞免疫表型。还测量了来自NADIM II试验（NCT03838159）的38例接受新辅助化疗免疫治疗的IIIA期NSCLC患者血浆样本中的CXCL13水平。PIR定义为非手术病例3个月内疾病进展或手术病例病理不完全缓解。结果：转移性PIR患者相较于非PIR患者具有更高的CXCL13血浆水平，尤其在BS2样本中，并在IO首个周期后表现出CXCL13水平更大幅度的升高。具有高BS2 CXCL13水平的患者显示出更短的PFS（p = 0.0002）和OS（p = 0.0007）。女性相较于男性病例表现出更低的高CXCL13百分比。CXCL13不影响体外NSCLC细胞系的生长。此外，CXCL13/CXCR5轴的表达局限于肿瘤的免疫区室。血浆CXCL13水平与PD-L1 TPS表达及肿瘤组织中三级淋巴结构（TLS）密度无关。然而在系统水平，具有高CXCL13水平的患者在首个IO周期后表现出受损的B和T细胞表型，以及升高的炎症细胞因子水平。最后，可切除病例中的高BS2 CXCL13水平也与PIR相关。结论：IO首个周期后升高的CXCL13水平与NSCLC中的PIR及改变的外周免疫谱相关，支持其作为这些患者预后生物标志物的潜力。
研究背景：非小细胞肺癌（NSCLC）约占所有肺癌的85%，仍是全球癌症相关死亡的主要原因。以抗PD-1/PD-L1轴抑制剂为代表的免疫治疗（IO）显著改善了患者临床结局，但仍有部分患者表现出免疫治疗原发耐药（PIR，Primary IO Resistance），导致临床预后较差。目前，肿瘤内因素（如PD-L1表达、低肿瘤突变负荷TMB、HLA I类抗原呈递缺陷）和外周免疫因素（如肿瘤微环境TME的免疫组成）对PIR的贡献尚不清晰，且缺乏可靠的生物标志物来准确识别IO治疗的应答者。CXCL13（C-X-C基序趋化因子配体13）又称B淋巴细胞趋化因子（BLC），通过招募B细胞及部分T细胞（如滤泡辅助T细胞Tfh）在免疫调节中发挥关键作用，其/CXCR5轴对三级淋巴结构（TLS）的形成及功能至关重要；但在肿瘤中CXCL13具有双重角色，局部TLS相关CXCL13通常预示较好预后，而系统性升高的CXCL13则关联转移进展、不良预后及治疗耐药。因此，研究人员开展此项研究，旨在评估血浆CXCL13水平与NSCLC患者IO治疗结局的关联，并探讨其作为PIR无创生物标志物的潜力。论文发表在《Biomarker Research》。
主要关键技术方法：研究人员使用了两个独立NSCLC队列：一是来自西班牙15个中心的观察性、多中心真实世界BLI-O项目的177例IV期转移性NSCLC患者（接受IO单药或化疗联合IO一线治疗、或IO单药二线治疗）；二是NADIM II临床试验（NCT03838159）的38例IIIA/B期潜在可切除局部晚期NSCLC患者（接受新辅助化疗联合IO）。研究人员在基线（BS1）及IO首个周期后（BS2）采集外周血样本，分离血浆和外周血单核细胞（PBMC）；采用细胞因子阵列（BLI-O队列）和ELISA（NADIM II队列）定量血浆CXCL13及其他细胞因子；通过流式细胞术分析BS2 PBMC的B细胞与T细胞免疫表型；利用单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学分析免疫区室及CXCL13/CXCR5轴分布；通过免疫组化（IHC）评估PD-L1肿瘤比例评分（TPS），通过多重免疫荧光评估肿瘤组织TLS及成熟TLS（mTLS）密度；以非手术患者3个月内放射学疾病进展、手术患者术后肿瘤残留存活细胞>10%（不完全病理缓解IPR）定义PIR；采用ROC曲线确定CXCL13分层截断值，并通过Kaplan-Meier生存分析、多变量Cox比例风险回归等统计方法分析预后价值。
研究结果：
高IO后CXCL13水平与转移性NSCLC的PIR相关：在177例转移性NSCLC患者中，23.2%为PIR（3个月内疾病进展）。PIR患者在基线（BS1）即具有高于非PIR的CXCL13水平（p=0.042），而在IO首个周期后（BS2）差异更显著（p=0.0002），且PIR患者BS2较BS1的CXCL13升高幅度更大（p=0.037）。以ROC曲线确定的BS2 CXCL13截断值（8469任意单位，AUC=0.743）分层，高BS2 CXCL13组PIR占比51.5%，低BS2 CXCL13组PIR占比仅13.8%（p=0.0002）。高BS2 CXCL13患者中位PFS（2.8月 vs 8.5月，HR=2.25，p=0.0002）和中位OS（5.9月 vs 17.5月，HR=2.32，p=0.0007）均显著更短。多变量Cox回归显示，BS2 CXCL13是PFS（HR=2.85，p<0.001）和OS（HR=2.40，p=0.002）的独立预后因子，且高BS2 CXCL13在男性中更常见，女性大多为低BS2 CXCL13且生存与低BS2 CXCL13男性相似。
IO首个周期后高血浆CXCL13水平与改变的外周B细胞免疫表型相关：NSCLC细胞系不表达CXCR5，CXCL13处理不影响肿瘤细胞增殖；空间转录组显示CXCR5主要表达于基质区、B细胞及TLS区域，单细胞PBMC分析显示CXCR5几乎仅限B细胞表达；血浆CXCL13水平与肿瘤PD-L1 TPS、肿瘤TLS/mTLS密度均无关联。高BS2 CXCL13患者外周B细胞显示：过渡B细胞及活化过渡B细胞（CD25+）频率更低（p=0.002、p=0.010），初始B细胞CD24和CD38中位荧光强度（MFI）更低（提示更成熟表型，p=0.002、p=0.046），记忆B细胞频率及CD27 MFI更低（提示记忆形成受损，p=0.024、p=0.018）。
高CXCL13水平关联T细胞失调及炎症细胞因子谱升高：高BS2 CXCL13患者外周CD8+ T细胞中活化细胞毒性T细胞（CD28+）频率更低（p=0.011），LAG3+及PD-L1+亚群频率更高（提示抑制表型，p=0.010、p=0.005），具有外出血管能力（CD62L+）的细胞毒性T细胞及记忆亚群（CD45RA- CD45RO+）频率更低（p=0.005、p=0.022）。此外，高BS2 CXCL13患者血浆中IFN-γ、IL-1α、G-CSF等多种炎症细胞因子水平显著升高，无细胞因子下调，提示IO首个周期后呈更炎症的循环环境。
IO首个周期后高CXCL13血浆水平是可切除NSCLC的PIR生物标志物：在NADIM II队列38例患者中，PIR定义为不完全病理缓解（IPR，>10%残留存活肿瘤，42.1%）。虽然基线CXCL13无组间差异（p=0.218），但PIR患者IO首个周期后CXCL13水平显著更高（p=0.005）；以BS2截断值311 pg/ml分层，高BS2 CXCL13组PIR占比72.7%，低BS2 CXCL13组仅22.2%（p=0.007）。
讨论部分总结：研究人员讨论指出，PIR在NSCLC中发生率近30%，本研究采用3个月严格 cutoff 定义转移性PIR、IPR定义可切除PIR，所有PIR患者均接受至少2周期治疗，可捕获明确原发耐药。传统肿瘤内因素预测PIR价值有限，外周血可反映系统免疫应答，是更具信息的无创替代。两个不同特征队列均显示IO首个周期后（而非基线）高血浆CXCL13关联PIR，突出早期纵向监测的重要性；CXCL13预后价值独立于年龄、治疗方案及ECOG状态，虽高CXCL13患者年龄更大（可能与“炎性衰老”相关），但年龄本身不关联PIR。存在性别差异：大多数女性为低BS2 CXCL13，生存与低BS2 CXCL13男性相当，可能与性别免疫差异及雌激素影响B细胞活化有关。血浆CXCL13与组织PD-L1 TPS无关联，可提供互补信息，是早期风险分层的微创生物标志物。CXCL13在肿瘤内关联TLS及有利预后，但血浆CXCL13与肿瘤TLS/mTLS密度无关联，主要作为系统免疫调节物，关联外周B/T细胞功能失调及促炎细胞因子谱。既往升高CXCL13多关联不良预后，但本研究首次将其关联系统免疫表型失调，NSCLC细胞不表达CXCR5、CXCL13不影响肿瘤增殖，CXCL13/CXCR5轴不直接调控NSCLC肿瘤细胞内在行为。高CXCL13患者B细胞分化轴扰动：过渡B细胞耗竭（可能加速成熟、异常迁出或招募至炎症组织），初始B细胞更成熟表型但记忆B细胞频率及CD27更低（记忆形成受损），过渡B细胞具有免疫调节功能，其耗竭可能去除系统免疫活化关键制动、促进功能失调应答。T细胞也受影响：活化细胞毒性T细胞更少、耗竭/抑制表型更多、外出血管记忆亚群更少，升高促炎介质可能过度刺激T细胞致耗竭。研究仍不确定CXCL13是主动促成免疫失调还是仅反映PIR相关免疫失调，需进一步机制研究；局限性包括NADIM II队列样本量有限、CXCL13 cutoff 需独立验证、部分亚组样本量小、两队列检测CXCL13方法不同（但均为常用验证方法，两队列阳性结果支持其效用）。
结论翻译：综上所述，IO首个周期后升高的血浆CXCL13水平与非小细胞肺癌（NSCLC）患者的免疫治疗原发耐药（PIR）相关，且与以未成熟及耗竭免疫系统为特征的系统性炎症增加相关，突显其作为预测PIR的早期生物标志物的前景。
