显微镜技术中的一个基本挑战在于高时空分辨率、信噪比（SNR）与生物相容性之间的固有权衡1。为了解决这个问题，库珀斯等人在《光：科学与应用》（Light: Science & Applications）杂志上报道了干涉式图像扫描显微镜（iISM），该技术能够在极低的光剂量下实现活细胞内精细结构的无标记超分辨率成像（见图 1）2。

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图1此图像的替代文本可能是通过AI生成的。
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iISM重建的工作流程以及重建前后点扩散函数（PSF）的比较

图像扫描显微镜（ISM）作为连接传统共聚焦显微镜和超分辨率成像的桥梁。通过使用阵列探测器捕获原本会被共聚焦针孔阻挡的离轴光子，ISM应用像素重分配（pixel reassignment, PR）进行空间校正。由于这种方法避免了光子通量的损失，因此将分辨率提升到了共聚焦极限，同时保持了高信噪比3,4。然而，传统的ISM框架，无论是通过光学硬件还是数字算法（如自适应像素重分配（APR）实现的，都基于非相干成像模型，其中最终图像是强度的线性叠加。这种基于强度的范式在与相干成像技术（如干涉散射显微镜（iSCAT）结合时面临重大挑战。在相干成像中，系统遵循复杂振幅叠加的原理，强度图像中编码的相位信息会导致相位翻转，使得依赖强度相关的传统ISM算法失效。表 1 对各种ISM重建方法进行了比较总结。

表1 不同ISM重建方法的比较总结
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为了克服这一挑战，作者开发了一种新型的iISM系统，该系统结合了iSCAT和ISM的优势。前者通过散射光与参考光之间的干涉实现高灵敏度的无标记纳米结构检测，而后者则通过使用阵列探测器精细采样焦点并应用重建算法来提高空间分辨率，超越了衍射极限。在硬件实现方面，该系统采用了共聚焦反射几何结构，并使用sCMOS相机记录完整的微图像。为了解决线性偏振光在干涉成像中通常会导致各向异性点扩散函数（PSF）的问题，作者特别引入了圆偏振照明，确保了干涉PSF的旋转对称性，最小化了测量误差，从而为后续的高精度图像重建奠定了坚实的物理基础。

在算法上，作者提出了一种基于径向方差变换（radial variance transform, RVT）的改进型APR工作流程。该过程首先使用RVT将包含相位信息的干涉微图像转换为反映局部对称性的强度图，从而模拟非相干成像特性。在此基础上，进行相位互相关（phase cross-correlation, PCC）以提取精确的位移向量，然后将其映射回原始干涉数据中进行亚像素信号重分配。这种软硬件结合的策略实现了高信噪比的无标记超分辨率成像。实验数据表明，iISM的横向分辨率为约120纳米。得益于相干成像和ISM的双重优势，iISM在相同的光子通量下实现了高达38的对比度噪声比。这一性能比传统的封闭针孔（约10纳米）和开放针孔（约14纳米）共聚焦模式分别提高了约4倍和3倍，并显著抑制了背景噪声。

在活细胞成像中，iISM表现出卓越的性能。该系统所需的入射功率仅为0.5微瓦，比类似的共聚焦iSCAT技术低约10倍。这种极低的剂量使得在COS-7细胞中可以清晰地分辨线粒体、内质网管状结构和肌动蛋白纤维，且在整个长期观察过程中不会引起明显的光毒性。值得注意的是，iISM图像中的正负干涉对比直接编码了细胞器相对于焦平面的纳米级轴向位置，从而提供了三维形态感知的额外维度。此外，该研究还强调了iISM与荧光ISM之间的关联成像潜力。虽然荧光通道提供了肌动蛋白的分子特异性，但iISM通道凭借其更高的灵敏度揭示了以前不可见的丝状伪足和周围无标记结构的全景。这种互补性为在接近生理条件下解析复杂的细胞内相互作用提供了新的观察窗口。

作为干涉式ISM的首次实验验证，这项工作不仅证实了将相干散射信号整合到ISM架构中的可行性，还为无标记超分辨率成像建立了新的范式。与单一模式方法不同，结合无标记干涉和荧光检测的策略能够获取多维的互补信息。这种高质量的相关数据为智能图像分析提供了坚实的基础。展望未来，预计将iISM与智能算法（如事件触发传感）相结合，将能够在极低光毒性的条件下实现活细胞的长期多维动态分析。