SWI3A/B调控地钱营养生长向生殖生长的转变

《Plant Reproduction》：SWI3A/B regulates the transition from vegetative to reproductive phase in the liverwort Marchantia polymorpha

　　

陆生植物在单倍体和二倍体的多细胞阶段之间交替，需要营养生长与有性繁殖之间的紧密协调。研究人员对非维管植物地钱（Marchantia polymorpha）中SWI/SNF复合体（SWI/SNF complex）的一个古老核心亚基SWI3A/B进行了研究。MpSWI3A/B启动子区的突变影响了雄株的配子枝托（gametangiophore）发育和精子发生（spermiogenesis），揭示了其在生殖发育中的雄性特异性作用。MpSWI3A/B突变株系在正常诱导生殖生长的条件下增强了雄株的营养繁殖（vegetative propagation）。该表型由转录组变化所支撑，显示MpSWI3A/B调控配子枝托起始的关键调控因子（如BONOBO、GLID）、精子发育与运动性（如DUO1、PKAR）以及无性繁殖（如KAI2）。研究人员提出，作为染色质水平（chromatin-level）的调控因子，MpSWI3A/B可能有助于平衡营养生长与生殖阶段，并强调该蛋白在探索协调陆生植物发育阶段转变的古老表观遗传功能方面具有重要价值。

陆生植物（Embryophyta）具有世代交替（alternation of generations）的生活史特征，其单倍体与二倍体阶段均为多细胞且通过有丝分裂增殖。与动物的二倍体生活史及许多轮藻（streptophyte algae）的单倍体生活史不同，陆生植物的两个世代均为多细胞。早期陆生植物登陆后仍依赖具鞭毛的精子（spermatozoid）进行受精。裸子植物中的苏铁等类群既产生具鞭毛的精子也产生花粉，而被子植物则完全依赖花粉受精。苔类植物（bryophytes）在植物登陆后不久即与维管植物分化，保留了具鞭毛的精子，且以配子体（单倍体）占优势，为研究植物雄性生殖发育的调控提供了有价值的体系。

生殖发育由遗传和表观遗传调控因子共同 orchestrate，这些调控机制可能起源于真核生物起源之初。在植物中，这一调控涉及DNA结合蛋白、染色质修饰因子及转录因子，它们通过表观遗传和蛋白-蛋白相互作用形成协调发育转变的网络。其中，染色质重塑复合体（chromatin-remodeling complexes, CRCs）在调控信号与染色质基础的转录控制之间形成关键节点。SWI3作为SWI/SNF（SWITCH/SUCROSE NONFERMENTING）染色质重塑复合体的关键亚基，通过介导组蛋白H3第27位赖氨酸的乙酰化（H3K27ac）调控核小体结构，从而激活生殖基因并拮抗PRC2（Polycomb Repressive Complex 2）介导的H3K27甲基化抑制作用。在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，SWI3依赖的花器官身份基因和生殖基因（如AP3和SEP）的乙酰化确保了适当的开花时间和可育种子的形成，同时拮抗H3K27me3介导的对FLOWERING LOCUS C（FLC）等关键生殖调控因子的沉默作用。

在被子植物中，SWI3家族已分化为四个成员，形成SWI3A/B和SWI3C/D两个系统发育群。然而，由于古老的基因组缩减事件，苔藓植物仅编码一个SWI3A/B类型的基因。在苔藓（Physcomitrium patens）中，SWI3A/B突变体无法降解精子发生过程中的细胞壁层，导致精子运动性受损、细胞质减少不完全、不育及雄性生殖缺陷。尽管SWI3A/B在拟南芥和地钱中的功能已有研究，但这两个物种均为雌雄同株（monoecious），其在配子体分化、转录调控及亲本贡献中的性别特异性作用尚不明确。地钱作为雌雄异株（dioecious）的苔类植物，具有决定性别的性染色体，为研究这一问题提供了理想体系。此外，地钱中控制配子囊发育的基因在营养生长阶段即已差异性表达，暗示了其在生殖器官形成前即存在性别特异性调控。

在地钱中，营养生长向生殖发育的转变由远红光（far-red, FR）诱导，通过光敏色素MpPHY感知并调控MpPIF（PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR）以启动配子枝托形成。MpBONOBO（MpBNB）与LRL/DROP（LOTUS JAPONICUS ROOTHAIRLESS-LIKE/DEFECTIVE REGION OF POLLEN）蛋白形成异二聚体，构成保守的bHLH模块，调控生殖细胞分化和配子枝托发育。MpBNB同时激活MpGLID（GERMLINE IDENTITY DETERMINANT），促进配子囊发育过程中雄性生殖细胞样细胞的形成。MpBNB在雌性生殖细胞前体细胞中的积累需要组氨酸激酶MpCKI1（CYTOKININ-INDEPENDENT 1）介导的不对称细胞分裂以建立颈卵器生殖系。赤霉素相关二萜途径涉及MpCPS（ent-copalyl diphosphate synthase）和MpKOL（ent-kaurene oxidase-like细胞色素P450），对远红光依赖的配子枝托进一步发育至关重要。KNOX/BELL家族的MpKNOX1、MpBELL1、MpBELL4和MpBELL5等转录因子参与合子发育和生殖细胞分化。R2R3-MYB转录因子MpDUO1（DUO POLLEN 1）对精子分化至关重要，而MpPKAR（Protein Kinase A regulatory subunit）和径向辐条蛋白同源物Mp6g07660等基因参与精子鞭毛的形成与运动性。然而，协调这些基因调控程序的染色质重塑复合体的作用在很大程度上仍属未知。

研究人员对MpSWI3A/B进行了研究，结果表明该蛋白调控雄株从营养生长向生殖生长的转变，并控制性发育的关键方面。MpSWI3A/B过表达突变体强化了营养繁殖，并延迟了性器官的发育，提示MpSWI3A/B可能作为这些不同的生存与繁殖策略之间的表观遗传控制点。

SWI3A/B调控地钱的生殖发育与精子发生

研究人员首先分析了地钱中SWI3A/B的进化地位。地钱中有两个拷贝编码该蛋白，与拟南芥的SWI3A/B和SWI3C/D家族聚类。结构域分析验证了MYB/SANT结构域的存在，而SWI3C/D还含有锌指结构域以区别于SWI3A/B。这进一步确认Mp8g15610（即Mapoly0079s0052）代表苔藓植物的SWI3A/B同源物（记为MpSWI3A/B）。

为研究SWI3A/B在单倍体-二倍体转变和性发育中的作用，研究人员利用CRISPR/Cas9技术尝试构建雄性和雌性MpSWI3A/B突变体。针对编码区的sgRNA未能获得任何突变转化体，而针对5'上游区域的sgRNA获得了携带启动子插入、缺失或替换的雄性和雌性突变体。定量实时PCR显示突变体中MpSWI3A/B表达上调，因此将其命名为swi3a/b过表达雄性（swi3a/b^oe-♂）和swi3a/b过表达雌性（swi3a/b^oe-♀）。这些突变体在营养生长方面没有明显缺陷。

在白光（WL）补充远红光（FR）诱导生殖转变条件下，野生型和swi3a/b^oe-♂均在12天内形成精子器托（antheridiophore）进入生殖阶段，但swi3a/b^oe-♂产生的精子器托数量约为野生型的一半。相比之下，突变体的颈卵器托（archegoniophore）产量未发生变化。突变体还表现出与野生型不同的分枝和分生组织增殖模式，这可能影响了配子枝托的发育和数量。

鉴于MpSWI3A/B在精子器托发育中的作用，研究人员进一步检查了swi3a/b^oe-♂精子器托是否产生具运动性的精子。野生型精子正常成熟至第5阶段，而swi3a/b^oe-♂精子频繁停滞在早期阶段。野生型中38.5%的精子仍被包被，而swi3a/b^oe-♂中这一比例增加至55.6%，表明精子发育存在较大差异。此外，swi3a/b^oe-♂精子表现出显著更高的直线速度、更大的前进线性度和总体增加的游动速度。这些结果表明MpSWI3A/B影响精子发生的早期阶段及成熟精子的运动动力学。

MpSWI3A/B在精子器和精子器托中的高表达进一步证实了其在雄性生殖发育中的作用。研究人员对生长于白光补充远红光14天的植株进行了比较RNA-seq分析。swi3a/b^oe-♂显示584个基因上调和409个基因下调（|log₂FC| > 2）。差异表达基因的功能注释显示植物防御、过氧化物酶活性和细胞壁重塑等类别富集。

在性生殖和无性生殖相关基因中，配子枝托和配子囊发育相关的MpBONOBO（MpBNB）和MpGLID强烈上调（log₂FC > 3），而MpPIF、MpCKI1、MpCPS和MpKOL2/3下调。单倍体-二倍体转变相关基因呈现混合模式：MpBELL1和MpBELL5上调，而MpKNOX1和MpBELL4下调。精子分化和运动性相关转录本，包括精子发生的核心调控因子MpDUO1、运动性调控因子MpPKAR以及鞭毛径向辐条蛋白同源物Mp6g07660，均呈上调。这些模式与地钱swi3a/b^oe-♂精子中观察到的形态和运动性变化一致，也与地钱SWI3A/B功能缺失导致晚期成熟障碍的现象相符。

SWI3A/B过表达强化营养生长

在远红光条件下，野生型完成生殖转变，包括叶状体扁平化、配子枝托形成和空的芽胞杯（gemma cup），而swi3a/b^oe-♂表现出配子枝托形成延迟。然而，swi3a/b^oe-♂产生的芽胞杯数量（16.2 ± 1.5）显著多于野生型雄性（10.5 ± 1.2）和雌性（9.7 ± 1.25）。野生型抑制芽胞产生时，swi3a/b^oe-♂在第10天产生的芽胞数量增加了13.5倍。这些结果表明，MpSWI3A/B过表达在白光补充远红光条件下通过过量芽胞产生强化无性繁殖，同时显示配子枝托形成延迟和精子成熟缺陷——两者均为有性繁殖的标志。

这一表型与营养生长相关基因的表达变化相关，包括芽胞形成关键因子MpKAI2B（KARRIKIN INSENSITIVE2）的显著过表达。此外，多个bHLH转录因子（MpSETA、MpBHLH29、MpBHLH30、MpBHLH31、MpBHLH21和MpPIF）下调，而晚期胚胎发生相关基因MpLEA-like44和MpLEA-like45强烈上调。这些转录变化共同提示，MpSWI3A/B调控性分化相关基因，也可能直接或间接影响无性繁殖相关基因的表达。因此，研究人员假设MpSWI3A/B可能在地钱中作为染色质水平的开关，平衡营养生长和生殖生长，而非单向控制生殖起始。

在讨论部分，研究人员首先将陆生植物的生殖策略置于更广阔的进化背景下。有性生殖是真核生命的决定性特征，通过单倍体配子融合形成二倍体合子确保遗传重组。从水生到陆生的转变伴随新的发育结构和调控线索的演化，以确保在无水环境中配子相遇和受精。苔藓植物作为早期陆生植物，为研究这种生殖复杂性的起源提供了窗口，其生殖调控机制先于花粉和种子的演化。然而，目前对营养生长-生殖生长转变调控网络的理解主要来自被子植物研究。拟南芥中SWI3调节开花时间和生殖器官形成等多个生殖相关性状，AtSWI3A或AtSWI3B的缺失分别导致胚胎败育和雄性不育，而AtSWI3C或AtSWI3D的突变改变性器官发育。本研究在地钱这一与种子植物姊妹的苔藓植物谱系中发现了类似作用。

地钱的性生殖通过整合远红光和光周期信号的光信号通路诱导。驱动雄性生殖细胞前体形成的关键基因MpBNB和MpGLID在swi3a/b^oe-♂中显著上调，但植株发育出更少的配子枝托。研究人员推测，MpSWI3A/B过表达可能导致这些基因在营养组织中的过早或异位激活，产生生殖诱导的转录特征而不伴随适当的器官分化。这种生殖系指定与器官发生之间的解偶联可能反映了远红光-光敏色素-PIF信号通路的受损和赤霉素（gibberellin, GA）生物合成的减少，与观察到的MpPIF、MpCPS和MpKOL下调一致。PIF和GA依赖途径作用于MpBNB-MpGLID模块上游促进器官起始和成熟，它们的下调可能削弱配子枝托形成，即使生殖系标志物仍保持高水平。

除雄性生殖发育作用外，研究结果还提示了过量SWI3A/B导致生殖发育延迟时的有趣响应——通过过量芽胞产生强化营养繁殖。芽胞产生和营养生长的关键调控因子MpKAI2在swi3a/b^oe-♂中的强烈过表达奠定了营养生长强化的基础。这一发现提示SWI3可能作为表观遗传调控因子，在苔藓植物中平衡营养和生殖程序的平衡。这种向营养繁殖的转变，特别是在生殖生长受损或延迟的品系中，可能反映了一种赌注对冲（bet-hedging）策略，即在性生殖受损或延迟时通过营养繁殖增强存活。这种发育可塑性对于早期陆生植物适应新陆地胁迫的生存可能至关重要，并继续促进现存苔藓植物在不同生境中的恢复力。

研究结论部分指出，本研究表明SWI3A/B是调控地钱雄株营养繁殖和性生殖之间平衡的关键染色质调控因子。这是首次报道SWI3A/B在生殖阶段前（配子枝托形成前）的作用，与其他物种中的发现形成对比。通过调控关键调控位点的可及性，MpSWI3A/B可能整合环境和发育信号以影响细胞强化营养或生殖命运。在分子水平上，SWI3A/B通过调控H3K27乙酰化，可能作为PRC2（H3K27me3抑制性标记的书写者）的对应物发挥作用。进一步阐明SWI3A/B介导的染色质重塑如何调控这些发育转变，将揭示苔藓植物生殖可塑性的分子基础，并为理解染色质动态和SWI3A/B等因子的多样化如何促进早期陆生植物从可逆的营养-生殖平衡向被子植物固定花器官承诺的转变提供进化洞见。染色质调控整合环境和发育信号以决定生殖命运的机制在被子植物之外仍知之甚少，苔藓植物特别是雌雄异株物种为揭示这些古老过程如何演化为复杂陆生植物生殖策略提供了强大模型。

该研究还存在一定局限性：90个独立品系中仅四个携带突变且均位于启动子区，提示MpSWI3A/B可能是必需基因；过表达品系的表型可能受过量蛋白非特异性相互作用的影响，目前尚不清楚这些表型是功能获得还是功能缺失所致；突变产生的孢子背景可能存在非克隆性问题；RNA-seq分辨率有限，未来需针对不同组织和发育阶段进行分析。未来研究包括ChIP-seq以鉴定SWI3A/B靶基因，以及遗传杂交评估swi3a/b^oe-♂的育性，将有助于确定SWI3是否不仅影响生殖发育还影响地钱的世代交替。