农杆菌介导的商业传家宝番茄品种转化优化及基于CRISPR/Cas9基因组编辑的新性状开发

《Planta》：Optimization of Agrobacterium-mediated transformation of commercial heirloom tomato cultivars to develop novel traits via CRISPR/Cas9 genome editing

　　

蔬菜作物番茄的遗传改良依赖于CRISPR/Cas系统的有效递送。既往番茄转化方案主要针对商业相关性极低的数个栽培种（M82、Ailsa Craig、Microtom、Sweet-100），尚不清楚这些方案能否直接应用于其他具商业价值的品种。传家宝番茄因风味浓郁多样备受青睐，但尚未通过常规育种或转基因、基因组编辑等生物技术途径进行系统性作物改良。研究人员测试了6种在美国具优异风味与市场相关性的传家宝栽培种的转化与再生能力，随后优化了生根条件并利用GRF4-GIF1嵌合发育调控因子成功获得转基因植株，最终评估了CRISPR/Cas9基因组编辑系统在多个栽培种中的靶向遗传修饰效率。结果表明，优化方案实现了多个传家宝品种的转化，包括获得靶向修饰株型与开花期基因的基因编辑植株。该结果为构建利用基因组编辑向地方及区域传家宝品种导入优异性状的技术平台奠定了基础。

该研究针对传家宝番茄缺乏系统性生物技术改良的现状展开。番茄是全球种植与消费最广泛的蔬菜之一，近年全球产量约达1.9亿吨，在都市农业与区域农业生产中具有重要地位。传家宝番茄为树龄≥50年的开放授粉品种，以风味多样浓郁著称，但既往遗传改良多集中于M82、Ailsa Craig等模式栽培种，针对具商业价值的传家宝品种的转化体系尚未建立，限制了其产量潜力提升与小型农业生产效益改善。现有转化方案在传家宝品种中存在再生效率低、生根困难等问题，无法满足基因组编辑的应用需求。为此，研究人员以美国市场常见的6种优质传家宝番茄为材料，优化农杆菌介导的转化体系，结合发育调控因子与CRISPR/Cas9技术，旨在建立适用于该类品种的生物技术改良平台。相关研究发表于《Planta》。

研究采用的关键技术方法包括：收集美国市场6种代表性传家宝番茄种子（购自Johnny’s Seeds与Annie’s heirloom seeds）及对照M82栽培种；基于MoClo Golden Gate克隆系统构建含Cas9、靶向Br与SP5G基因的gRNA及筛选标记NPTII的二元载体，部分载体额外整合GRF4-GIF1嵌合表达盒；利用农杆菌GV3101菌株介导子叶外植体转化，通过卡那霉素筛选获得再生植株；采用改良CTAB法提取基因组DNA，通过PCR扩增与Sanger测序鉴定靶基因编辑类型；利用双比例Z检验比较不同基因型与载体的转化效率差异。

研究结果分为三部分。第一部分为多个番茄栽培种转化效率的初始评估。研究人员首先采用已报道的M82栽培种转化方案测试6种传家宝品种，结果显示对照M82转化效率约为30%，而Brandywine Pink与Jubilee分别仅为8.8%与3.4%，且多数传家宝品种再生芽在生根培养基中6周仍无生根迹象，表明其再生潜力显著低于模式栽培种，需针对性优化生根条件与再生策略。第二部分为生根培养基与条件优化以培育基因组编辑传家宝番茄。研究人员调整生根阶段培养基成分与光照强度，测试发现添加0.5 mg/L吲哚-3-丁酸（IBA）与0.5 g/L活性炭的培养基可有效诱导所有测试品种生根，同时降低光照强度至6–9 μmol/m²s^?1、室温培养可促进根系发育。采用优化方案后，Jubilee转化效率从初始的3.4%提升至22.7%，M82达76.6%。对T0代植株靶基因PCR与测序分析显示，CRISPR/Cas9系统可在Br与SP5G基因靶区产生插入缺失突变，其中Amana Orange栽培种获得双等位突变体，表现为矮化与早花表型，提示目标基因功能丧失。第三部分为发育调控因子在传家宝番茄再生中的应用。研究人员测试GRF4-GIF1嵌合基因对再生效率的影响，发现携带该表达盒的载体可使多数品种再生周期缩短1–3周，但仅Jubilee栽培种转化效率显著提升（双比例Z检验p值<0.01），表明该调控因子可加速再生进程，但对不同品种的转化效率提升存在差异。

研究结论指出，传家宝番茄可通过优化的农杆菌介导转化体系实现稳定遗传转化与CRISPR/Cas9基因组编辑。添加IBA与活性炭的生根培养基可有效解决转基因芽生根障碍，GRF4-GIF1发育调控因子可加快再生进程，二者结合可实现株型与开花期等性状的精准改良。该成果为地方与区域传家宝番茄的基因组编辑育种提供了可靠的技术基础，有助于提升特色番茄品种的生产效益与适应性。