综述：韧皮部筛分子结构与功能的细胞生物学研究进展

《Protoplasma》：Sieve elements. Hidden corners, fierce debates, future prospects

　　

研究人员对植物韧皮部筛分子（SE）的细胞生物学特性进行了系统性综述，重点关注其特化的无核结构与功能维持机制。筛分子作为高等植物长距离运输的同化产物通道，在发育过程中经历显著的细胞重组，包括细胞核降解、核糖体丢失及液泡膜破裂，最终形成以微管网络为核心的成熟状态。研究指出，筛分子与伴胞（CC）通过孔-胞间连丝单位（PPU）形成紧密的功能复合体，伴胞通过PPU向筛分子持续供应蛋白质、RNA及能量物质以维持其代谢活性。在调控机制方面，胞质钙离子（Ca2+）浓度变化是控制筛板通透性的核心因素，可通过激活胼胝质合成酶（GSL）诱导胼胝质沉积，或通过触发筛分子封堵蛋白（SEOR）构象改变及福里体（forisome）分散实现筛孔的瞬时或持久封闭。此外，研究还探讨了韧皮部汁液采集方法对组分分析的干扰，强调了区分伴胞合成蛋白与筛分子固有成分的重要性，并提出了筛分子能量供应可能依赖伴胞质子泵建立的跨膜电位梯度的假说。

筛分子细胞骨架

关于筛分子中是否存在功能性细胞骨架长期存在争议。早期利用FABD2:GFP未能检测到肌动蛋白丝，且从筛管伤流液中鉴定的细胞骨架蛋白被质疑是分化残留物而非功能组分。然而，多项证据支持筛分子保留特化的细胞骨架结构：荧光鬼笔环肽标记显示存在丝状网络，免疫定位证实了肌动蛋白丝的存在，且其定位与膜-壁锚定结构及福里体的潜在连接位点一致。功能层面，拟南芥中肌动蛋白解聚因子（ADF）参与抗蚜虫侵染的过程，暗示细胞骨架在防御反应中的作用。福里体的快速可逆构象变化及运动亦难以脱离细胞骨架参与解释。结构上，广泛存在的膜接触位点（MCS）系统足以维持细胞器定位，但可能不足以支撑光滑内质网（SER）网络的机械稳定性，因此简化的细胞骨架支架可能对稳定SER及相关细胞器至关重要，并可能为通过孔-胞间连丝单位（PPU）递送的蛋白质及筛管内大量未知囊泡提供轨道式靶向分选与运输系统。

筛分子线粒体

成熟筛分子中的线粒体是具有谜团性的组分。早期罗丹明摄取实验表明其具有残留活性，但其数量稀少，似乎不足以满足压力驱动运输及膜充能的巨大能量需求。其频繁出现的肿胀或部分退化形态进一步提示呼吸能力有限。与此形成鲜明对比的是，伴胞（CC）中含有大量高活性的线粒体，被广泛认为是筛分子功能的主要能量供应者。分子生理学证据表明，筛分子自身的呼吸作用不足以维持糖的摄取与滞留。转基因研究表明，韧皮部特异性表达无机焦磷酸酶会干扰CC中的焦磷酸代谢，降低蔗糖分解与ATP合成，进而损害韧皮部装载并导致同化物在运输路径上的显著损失，这与筛分子能量生产不足的观点一致。此外，筛分子内的呼吸活动可能受限于体内低氧水平，蓖麻中筛管内的氧分压约为7%，约为大气水平的1/3，维管形成层中乙醇脱氢酶活性升高及乙醇积累均指示韧皮部附近处于低氧或部分厌氧条件，这可能限制线粒体呼吸并影响包括钙稳态在内的多种过程。另一个复杂性在于筛分子线粒体对显微固定过程的敏感性，与CC线粒体相比，其在制备过程中更易出现结构恶化，加之超微结构、基因组存留及代谢能力的诸多未解问题，使得筛分子线粒体的功能意义至今仍不明朗。

筛分子质体

筛分子中持续存在的微质组分包括小型、结构独特的质体（SE质体或P-质体）。P-质体存在于单子叶和双子叶植物的筛分子中，表现出显著的结构多样性。早期描述的含淀粉粒的P-质体经碘染色呈红色，但这被认为不太可能是伤口诱导筛板堵塞或作为碳水化合物储存库以支持筛分子代谢。Behnke将双子叶植物中的质体分为两类：S型质体不含蛋白内含物，仅含或无淀粉粒；P型质体含有纤维状或结晶状蛋白体，可含或不含淀粉。单子叶植物的筛分子质体则均匀含有楔形结晶蛋白体，这是该类群的一个共有衍征。推测功能包括参与茉莉酸介导的系统伤口反应信号传导及病原体防御。通过微电极技术从烟草筛分子原生质体中分离质体并进行PCR分析，初步结果显示存在质体DNA，结合活体PicoGreen染色证据，提示这些质体可能保留了支持筛分子维持的基因组，尽管仍需严格验证。鉴于质体通常拥有120-166个基因的环状基因组，这一发现具有重要意义。筛分子质体以其结构稳定性和对环境扰动的抵抗性著称，有观点认为它们在分化后可能变得无功能，但在高度重塑的细胞器中完全缺乏目的性似乎有悖常理。除代谢作用外，物理功能亦值得考虑：质体可能影响管腔流体动力学，稳定静止的周质层，或作为机械感受元件将流动信息传递给SER。目前，筛分子质体的确切功能仍是一个谜题。

丝状蛋白

除与周质线粒体和质体相关的蛋白外，筛分子管腔还含有多种蛋白aceous结构。一类主要成分是筛分子封堵相关蛋白（SEORs），它们组装成松散编织、看似无序的丝状网络。在拟南芥中，这些丝状物由AtSEOR1和AtSEOR2链共轭组成。健康植株中，它们不阻碍集流运输。然而，在受伤或病原体攻击时，筛孔会被可能由Ca²⁺修饰的SEOR1/SEOR2复合物形成的蛋白栓迅速密封。这种环境依赖性行为的机制归因于损伤或感染筛分子中Ca²⁺释放，促进SEOR丝状蛋白的融合与聚集。在烟草中，NtSEOR丝状蛋白沿纵向筛分子壁形成周质聚集体，并在受伤后堵塞筛板。此类结构在RNA干扰株系中大幅减少，导致受伤后同化物加速流失，凸显了SEOR介导封堵的保护功能。近期证据表明SEOR2可能还具有调节功能，在拟南芥Atseor1敲除突变体中，对植原体感染的抗性增强，游离SEOR2水平升高与钙介导的病原抗性基因表达增加及生长促进基因表达降低相关，暗示SEOR2参与平衡资源分配至生长与防御的调节平台。与SEORs根本不同的是葫芦科植物特有的韧皮部蛋白（PPs）。南瓜中的PP1（95 kDa）和二聚体PP2（48 kDa）可在体外组装成水不溶性大分子复合物，通过二硫键共价连接。这些不透水的PP1/PP2聚集体被认为是筛板封堵的原因。二硫键的形成源于谷胱甘肽介导的保护失效后的氧化作用。活体相关性通过南瓜叶尖灼伤实验得到证实，热处理后数分钟，距灼伤位点约10 cm处的筛管伤流液中可溶性PP1和PP2水平显著下降，同时筛板附近出现不溶性栓。热诱导沿筛管产生电势能波（EPW），伴随Ca²⁺内流。重新评估表明情况更为复杂：葫芦科植物中，切断后维管束韧皮部的溢泌迅速停止，而额外维管束韧皮部的溢泌可持续，后者含有高浓度PP，而维管束筛分子中的PP水平相对较低。因此，加热后短时间内观察到的栓很可能并非源自维管束PP聚集。另一种解释认为EPW诱导的Ca²⁺内流主要触发维管束筛分子中SEO介导的封堵。已在南瓜中鉴定到CmSEO1。因此，EPW可能启动串联封堵反应：维管束筛管中的SEO基封堵和额外维管束筛管中的PP基封堵。虽然尚未在PP蛋白中发现Ca²⁺结合位点，但Ca²⁺内流与活性氧（ROS）产生相关，ROS与PP2结合位点相互作用并有助于ROS稳态，使得ROS介导的PP巯基氧化成为PP1/PP2交联与筛管封堵的合理驱动因素。PP2则广泛分布于许多植物物种的韧皮部汁液中，其可溶性非聚集形式作为二聚体聚-GlcNAc结合凝集素，识别N-连接聚糖、几丁质及相关寡糖，使其成为针对蚜虫、真菌和细菌等韧皮部入侵生物的早期识别和防御组分。

福里体

早期电子显微镜观察在大豆筛分子中发现纺锤形蛋白体。后续观察到这些结构在未损伤的蚕豆筛分子中呈球形，共聚焦显微镜证实了其可在浓缩纺锤态与分散球态之间发生可逆转变，这些Ca²⁺响应体后被命名为福里体。当筛分子胞质Ca²⁺浓度超过阈值时，福里体分散并体积增大，当Ca²⁺水平下降时重新浓缩。在分散状态下，它们堵塞筛板，阻断集流运输。这种快速可逆的封堵无需ATP，仅依赖Ca²⁺诱导的物理化学变化。结构上，福里体由高度有序的纵向纤丝组成，包含筛分子封堵（SEO）蛋白家族成员。系统发育分析揭示了不同的SEO亚家族具有不同的结构功能，其中SEO-F亚家族编码福里体主体结构，SEO-T亚家族负责特征性的尾部。比较基因组学显示SEO基因在被子植物中广泛存在。异源表达研究表明MtSEO-F1和MtSEO-F4蛋白可自发组装成纤丝并最终形成类似天然福里体的纺锤形体。福里体已引起技术应用兴趣，作为自驱动蛋白装置，可在微流控系统中用作Ca²⁺控制的微阀。在韧皮部研究中，福里体充当筛分子Ca²⁺信号的固有报告器，用于检测对远距离热刺激和局部冷休克的响应，并推断筛分子Ca²⁺通道分布的不对称性。福里体的运动性暗示细胞骨架参与，肌动蛋白聚合抑制剂latrunculin A可抑制Ca²⁺诱导的无尾福里体分散，有尾福里体甚至能在Ca²⁺升高时逆集流跨越整个筛分子，同样被latrunculin A抑制，且鬼笔环肽荧光在分散的福里体周围积累，支持肌动蛋白参与。这些观察结果提示筛分子中存在肌动蛋白、Ca²⁺通透性通道与福里体之间的功能互作。

非分散性蛋白体

与分散性蛋白体相反，惰性非分散性蛋白体（NDBs）不响应筛分子内生理条件的变化。它们出现在至少39个被调查的植物科中，分布似乎局限于有限的分类群。NDBs表现出广泛的形态，包括复合球形、玫瑰花结状、杆状和纺锤形。值得注意的是，一些豆科植物中也报道了纺锤形NDBs，表明并非所有纺锤形蛋白体都对应可分散的福里体。缺乏分散性的原因在于杨树NDBs仅由SEOR1蛋白组成，支持SEOR1和SEOR2都是形成动态、Ca²⁺响应性蛋白结构所必需的这一观点。仅由SEOR1组成的NDBs不响应Ca²⁺升高或机械损伤。

筛分子中的蛋白酶体？

尽管筛分子中存在蛋白酶体的确凿证据仍然缺乏，但已从筛管伤流液中检测到泛素相关蛋白水解活性，蛋白质组学分析进一步支持蛋白酶体相关降解，在葫芦科和芸苔属筛管伤流液中分别鉴定出一百多种与蛋白水解相关的蛋白质。然而，成熟筛分子中蛋白酶体的存在和功能仍是推测性的，特别是考虑到对筛管伤流液是否真实反映筛分子内容的质疑。如果存在，蛋白酶体可能在无核细胞器的蛋白周转中起核心作用。另一种可能是筛分子中的蛋白降解通过胞质Lys63连接的聚泛素化发生，这种泛素化通过不依赖经典蛋白酶体系统的途径介导蛋白水解。

筛分子中钙水平的控制

钙在众多基本筛分子功能中扮演关键角色。即使在代谢简化的筛分子中，潜在的钙稳态网络预计也极为复杂。在具核细胞植物中，分布于各种膜上的众多Ca²⁺通透性通道产生高度动态的、时空协调的Ca²⁺特征，编码特定的生理反应。在筛分子中，哪些通道系统发挥作用在很大程度上仍未解决。已在筛分子中检测到Ca²⁺通透性通道，但其分子身份未知。它们可能位于筛分子质膜和SER膜上。已在筛分子原生质体质膜上证明存在机械敏感性Ca²⁺通道，电压敏感性通道可能参与EPW传播。配体激活的GLR家族通道，包括GLR3.3和GLR3.6，已被定位到筛分子、伴胞或SE-CC复合体。参与系统伤口信号传导的CNGC2和CNGC4通道也与韧皮部组织相关。筛板封堵后Ca²⁺升高的短暂性暗示存在主动的Ca²⁺移除机制。在植物细胞中，过量的胞质Ca²⁺通常由ACA型泵移除，将Ca²⁺转运至液泡、ER潴泡或质外体等储存区室。由于筛分子与伴胞之间存在密切的共质体连接，伴胞胞质中的Ca²⁺动态可能影响筛分子Ca²⁺水平。代谢活跃的伴胞液泡可作为主要的Ca²⁺储库。其他Ca²⁺输出途径，如质膜上的CAX交换器或ER膜上的ECA型泵和CCX转运蛋白，也可能参与筛分子的Ca²⁺处理。然而，直接在筛分子膜上鉴定Ca²⁺泵或Ca²⁺/H⁺交换器的工作仍然缺乏。因此，在相关通道、泵和交换器的分子身份被确定和定位之前，控制筛分子中Ca²⁺稳态的机制在很大程度上仍是假说性的。分离的筛分子原生质体为未来研究解决筛分子Ca²⁺调控的分子基础提供了一个有前景的系统。

Ca²⁺通透性通道在筛分子中的影响：筛孔的封堵与收缩

如前所述，胞质Ca²⁺水平升高会降低筛孔通透性，因为特化的筛分子蛋白可通过形成不透水栓来封堵筛孔。在豆科中，伤害及相关Ca²⁺增加诱导福里体分散迅速堵塞筛孔。类似的远端刺激（如灼烧远处叶尖）或植原体感染也可触发类似封堵。这些反应通常被解释为防止过量同化物损失和限制病原体入侵的保护机制。在葫芦科中也观察到对远端灼烧的快速响应，但机制根本不同，筛板似乎被PP蛋白聚集体堵塞，这种聚集可能不是由Ca²⁺直接介导，而是由电势能波（EPW）和伴随的Ca²⁺内流产生的氧化化合物介导。除了蛋白栓塞外，共质体通透性还可以通过在胞间连丝（PDs）和筛孔周围沉积β-1,3-葡聚糖（胼胝质） collar来调节。局部韧皮部损伤迅速诱导筛板上胼胝质沉积，收缩孔腔。大量研究表明胼胝质积累与共质体通透性呈负相关，支持胼胝质在调节共质体运输中的普遍作用。重要的是，胼胝质沉积是由胞质Ca²⁺升高触发的，通常需要比蛋白栓塞更高的阈值。目前模型认为PD颈区的胼胝质合成与分解受质膜结合的β-1,3-葡聚糖合酶（GSLs）和胞外β-1,3-葡聚糖酶（BGs）拮抗活动的调节。GSLs是大型PM驻留蛋白，构成多蛋白胼胝质合酶复合体（CalS全酶）的一部分，而BGs降解胼胝质以对抗孔收缩。在筛分子中，胼胝质合成受升高的Ca²⁺刺激，尽管Ca²⁺信号与CalS激活之间的分子联系尚未完全阐明。对于胞间连丝，膜联蛋白1（Annexin 1）被提议将Ca²⁺结合与GSL7激活偶联，其本身可能作为Ca²⁺通透性通道发挥作用。胼胝质合成的底物UDP-葡萄糖由蔗糖合酶依赖的途径提供，该途径受Rho型GTP酶Rop1激活。胼胝质合酶复合体密集地聚集在质膜微域中，促进快速的局部沉积。鉴于筛孔与胞间连丝的进化关系，筛孔收缩机制很可能与胞间连丝类似。

Ca²⁺通透性通道在筛分子中的影响：电势能波

植物中的电信号早在19世纪末就被认识到。早期工作区分了两种主要的EPW：动作电位（APs）和变异电位（VPs）。APs传播相对较快（0.5-10 cm s^-1），而VPs传播较慢（0.1-1.0 cm s^-1）。第三类系统电位（SPs）也被提出，速度约为5-6 cm s^-1。动作电位通常与非侵入性刺激相关。像神经元APs一样，它们表现出全或无行为：一旦膜去极化超过阈值，就会产生一个自传播的、具有特征振幅和速度的、独立于刺激强度的信号。AP的产生依赖于质膜上协调的电压依赖性离子通道。在AP前沿，去极化由电压激活通道介导的Ca²⁺内流启动，激活Ca²⁺依赖性Cl^-通道，导致Cl^-外流和进一步去极化。随后电压依赖性K⁺通道打开，允许K⁺外流和膜复极化。变异电位在起源和行为上与AP根本不同。它们通常由破坏性刺激触发，如灼烧、热水暴露、强机械挤压或草食动物攻击。与AP不同，VP振幅与刺激强度相关，并随距刺激距离的增加而衰减。VP通过时伴随显著的Ca²⁺内流和ROS产生，形成反馈环：Ca²⁺诱导的ROS产生（CIRP）刺激ROS生成，而ROS又可增强Ca²⁺释放或内流（ROS诱导的Ca²⁺释放，RICR）。结合微电极记录和荧光Ca²⁺指示剂及共聚焦显微镜的直接观察表明，在非侵入性刺激下，蚕豆筛分子发生快速的AP样去极化，随后缓慢复极化，这些信号不改变福里体构型，表明Ca²⁺内流轻微或中等。相比之下，灼烧远处叶尖会诱导初始AP峰后跟随长时间的去极化，被解释为VP，在此期间福里体分散并重新收缩，证明筛分子微质中发生了实质性的瞬时胞质Ca²⁺升高。在筛管汁液微滴中测量的Ca²⁺浓度低于理论上封堵蛋白所需的浓度。这种差异可由薄周质微区中靠近筛分子膜的Ca²⁺通道簇产生的局部Ca²⁺“热点”来解释。这些微域可瞬时达到足以触发福里体分散或其他Ca²⁺依赖性反应（如筛孔收缩）的高Ca²⁺浓度。VP机制仍不完全清楚，可能部分源于组织损伤造成的液压扰动，如维管薄壁细胞中影响邻近筛分子的瞬时膨压变化。传播可能涉及GLR型通道、CNGC型通道和机械敏感性Ca²⁺通道。精确的信号通路如何激活筛分子Ca²⁺通道仍未解决，但值得注意的是EPW传播速度取决于通路传导性。快速传输由低阻力的筛孔促进，较慢的传输通过胞间连丝或侧翼维管组织中的连续去极化发生。VPs是在筛管内自我放大还是代表来自邻近细胞的累积侧向信号尚不确定，也不排除多种机制并行运作。尽管机制不同，APs、VPs和SPs共享功能特征：都瞬时增加筛分子胞质Ca²⁺，并具有浓度依赖性效应。当Ca²⁺超过阈值时，筛孔可能被蛋白栓暂时封堵；甚至更高的Ca²⁺水平会触发胼胝质介导的收缩。APs引起轻微的Ca²⁺升高，主要功能在于快速长距离信号传导而不影响筛孔通透性。弱VPs诱导较大的Ca²⁺内流和瞬时蛋白介导的封堵，短暂中断集流运输，允许局部信号化合物积累。强VPs伴随大量的Ca²⁺内流，额外触发胼胝质沉积和共质体连接的暂时隔离，在通过韧皮部重新分配之前，允许局部的基因表达或代谢调整。总之，植物EPWs不太可能仅作为类似于动物神经信号的电信息。相反，它们似乎调节筛管周围维管细胞中的Ca²⁺特征，影响韧皮部流中的代谢、基因表达和化学信号传导。

筛分子与伴胞的相互作用

伴胞（CCs）被认为在维持筛分子功能中起核心作用，这归因于连接筛分子与伴胞的孔-胞间连丝单位（PPUs）。由于成熟筛分子缺乏细胞核和大部分蛋白质合成机制，必需蛋白必须由伴胞供应。早期证据来自发现筛分子凝集素特异性在葫芦科伴胞中表达。同样，AHA3（H⁺-ATP酶3）和SUC2（蔗糖转运蛋白2）等基因在伴胞中转录，而其编码蛋白则在筛分子膜上发挥作用。伴胞的特殊工作负荷也反映在其独特的转录组中，可能支持持续合成和递送维持筛分子所需的蛋白质。如果PPUs是CCs与SEs之间唯一的共质体途径，那么它们必须具有比普通胞间连丝大得多的功能直径。实验证明PPUs允许高达60 kDa的大分子通过。与此能力一致，筛管伤流液含有广泛的蛋白质和RNAs，包括泛素-26S蛋白水解系统的众多组分和参与活性氧物种解毒的酶。此外，数千种mRNA、许多小RNA（包括siRNAs和miRNAs）已在筛管汁液中鉴定出来，并被认为参与远端组织的转录或转录后调控。值得注意的是，tRNA在筛管伤流液中的检测出乎意料，因为无核筛分子中假定不存在翻译，有人提出tRNA可能反而促进mRNA的韧皮部移动性。最初，通过PPUs的大分子运输被认为是一个选择性的、高度调节的过程，类似于病毒在细胞间的运动。支持证据来自葫芦科韧皮部蛋白CmPP16，它能结合特定mRNA，增加胞间连丝的分子排阻限，并作为核糖核蛋白复合体通过胞间连丝鞘移动。然而，早期就出现了对严格选择性的质疑。引入伴胞的大分子葡聚糖被观察到进入筛分子，非天然GFP构建体也从CCs进入筛管。此外，许多嫁接移动的mRNA编码与一般细胞功能相关的蛋白质，而非专门的信号分子。为了调和这些发现，提出了选择性和非选择性运输共存模型。其他研究认为许多韧皮部移动的mRNA和蛋白质