《Trees》：Male sterility in natural, domesticated and feral populations of the gynodioecious European chestnut (Castanea sativa)
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欧洲栗（Castanea sativa Mill.）历经数个世纪的坚果生产选种，然而其驯化综合征（Domestication syndrome）仍缺乏明确表征。本研究调查了伊比利亚半岛西北部沿人类影响梯度（天然（野生大西洋群体）、驯化及野化（野生内陆群体）欧洲
欧洲栗（Castanea sativa Mill.）历经数个世纪的坚果生产选种，然而其驯化综合征（Domestication syndrome）仍缺乏明确表征。本研究调查了伊比利亚半岛西北部沿人类影响梯度（天然（野生大西洋群体）、驯化及野化（野生内陆群体）欧洲栗种质）在性别表达、遗传祖先及形态性状上的演化转变。研究人员分析了292份种质，利用核微卫星（Nuclear microsatellites）及雄花序（Male catkin）类型的形态学表征，并结合若干可能与雌性优势和驯化相关的性状进行分析。遗传结构分析强调了野生大西洋群体（以北大别（North Iberian, Nib）祖先为主且为雄性可育（长花丝，Longistaminate）个体）与野生内陆/驯化组（主要由Nib与地中海（Mediterranean）居群之间的种内杂交个体组成，表现出高性别比例（高达89%））之间的显著差异。研究结果表明与雄性不育相关的明确功能信号：雄性不育种质表现出显著更高的个体杂合度、更高的坐果率（0.82 对比 0.74），并且每个两性花序（Bisexual catkin）中的雌花序数量比可育种质多88%（3.61 对比 1.92）。此外，研究人员确定了不同性别类型间雄花序长度的显著差异，这一发现在分析同龄多样化野生树木集合时显现出来。这些结果提供了强有力的证据，表明雌性优势是欧洲栗驯化的驱动因素，说明针对坚果产量的选择倾向于雄性不育的种内杂交个体，并通过嫁接得以稳定。本研究阐明了欧洲栗（C. sativa）的人为演化历史，并强调了野化种群——作为地中海和本土居群遗传马赛克——作为新品种来源的作用。
论文解读：欧洲栗天然、驯化及野化种群中的雄性不育
研究背景与问题提出
欧洲栗（Castanea sativa Mill.）传统上被认为是雌雄同株（Monoecious）植物，在同一植株上着生单性雄花序和两性花序。然而，多项研究报道了以坚果生产为目的的驯化种群中广泛存在雄性不育（Male sterility）现象。雌全异株（Gynodioecy，指种群内雌雄同株个体与雌性个体共存）是一种影响少数植物物种的花多态性。在欧洲栗中，其遗传控制可为核控制或核质控制，后者称为细胞质雄性不育（Cytoplasmic Male Sterility, CMS）。雌性个体在自然雌全异株种群中的维持主要由两种机制驱动：一是雌性优势（Female advantage），即将不用于花粉生产的资源投资于雌花生产，从而产出更多花、果实和更大尺寸的种子；二是消除雌性个体后代中的近交。由于这两种优势，雄性不育可能是一些以果实或种子为栽培目的的物种驯化综合征（Domestication syndrome，指栽培种群相对于野生祖先由于有意和无意选择过程而产生的一系列形态变化）的关键组成部分。尽管欧洲栗分布广泛，但其驯化综合征尚未被充分描述。目前存在的一个关键问题是，野生种群中高比例的雄性不育树木究竟是自然存在的（即本土的且未受驯化种群基因流影响），还是野化（Feral，指全部或部分源自作物植物且无需任何干预即可自我繁殖）种群。此外，不同已识别居群（如北大别（Nib）、西地中海（Mw）和东地中海（Me））的种群间雄性不育的发生率尚未见描述。鉴于伊比利亚半岛西北部的加利西亚（Galicia）地区保留了完整的冰期避难所与高强度中世纪驯化区域，为分析可能已在欧洲其他地区消失的演化时间序列提供了独特的自然实验室。因此，研究人员开展此项研究，旨在定义欧洲栗驯化综合征的具体组成部分，阐明其人源演化历史，并揭示其花架构的演化，明确在坚果生产选择下性别组成、祖先和个体杂合度的显著表型和遗传转变。
主要技术方法概述
研究人员在伊比利亚半岛西北部的加利西亚地区开展研究，依据采样区（大西洋 vs 内陆加利西亚）及繁殖方式（种子繁殖的野生树 vs 果园中嫁接繁殖的品种）将种质划分为三类：野生大西洋（Wild Atlantic）、野生内陆（Wild Inland）和驯化（Domesticated），共计292份种质（野生257份，驯化35份）。研究人员利用8个核微卫星（SSR）标记进行基因分型，并使用Structure软件基于贝叶斯方法估算个体在三个已知祖先居群（Nib、Mw、Me）中的祖先系数（Ancestry values），从而划分祖先类别（北大别、地中海、杂交）。形态学上，研究人员依据雄花序花丝长度及花药发育情况将雄花序分为四种形态型：长花丝（Longistaminate，可育）、中花丝（Mesostaminate）、短花丝（Brachystaminate）和缺花药（Astaminate，不育），并合并为雄性可育与雄性不育进行分析。研究人员采用Larue和Petit开发的基于零截尾二项分布的方法估算坐果率（Fruit set, Ppol），并测量了两性花序中雌花序数量（Number of female inflorescences per bisexual catkin）及雄花序长度（Male catkin length）。数据统计方面，研究人员使用Fisher精确检验分析关联表，并使用广义线性模型（GLM，包括Beta回归、Gamma回归等）分析数量性状在不同种质、祖先及性别类型间的差异。
研究结果
Ancestry values of south-western European populations（伊比利亚西南部种群的祖先值）
研究人员对来自伊比利亚半岛、意大利和希腊共906份样本的微卫星数据进行Structure分析（K=3），明确了三个先前识别的集群：北大别居群（位于伊比利亚半岛北部）、西地中海居群（位于伊比利亚中南部及意大利）和东地中海居群（希腊）。K=3时的ΔK值为114.82，显示明确的种群结构。
Ancestry values of galician populations（加利西亚种群的祖先值）
在加利西亚的292份种质中，野生大西洋组主要由北大别祖先个体主导（84%），而野生内陆和驯化组主要由北大别与西地中海居群的种内杂交个体组成（69%），仅含少量纯北大别或地中海祖先个体。部分野生内陆群体（如Courel和Sil）甚至缺乏Nib祖先系数大于0.66的个体。
Stability of male catkin types（雄花序类型的稳定性）
对多无性系分株或多年评估的结果显示，雄花序类型的赋值稳定性各异。一些品种（如长花丝品种‘Negral’、‘Picona’，缺花药品种‘Branca’、‘Amarela’，短花丝品种‘Raigona’、‘Longal’等）表现出高稳定性（Stmc接近或等于1），而另一些雄性不育品种（如‘Puga de Afora’、‘Vérdea’、‘Famosa’等）稳定性较低（Stmc约0.5-0.68）。变化主要发生在相邻雄性不育类别间，少数在中间型与长花丝型间波动。
Other morphological features of flowers（花的其他形态学特征）
中花丝品种‘Rapada’观察到卷曲花丝；大多数中花丝和短花丝雄花序的花药呈棕色且不裂开；缺花药雄花序发育极度退化并早期脱落；此外，在某些雄性不育种质的两性花序中观察到雌蕊同化（Pistillody，雄花转变为雌蕊结构）现象。
Contingency tables（列联表）
野生大西洋与野生内陆（p<0.0001）、野生大西洋与驯化组（p<0.0001）在祖先组成上存在显著差异，而野生内陆与驯化组相似（p=0.982）。在雄花序类型频率上，三组间均存在显著差异（野生大西洋 vs 野生内陆 p<0.0001；野生大西洋 vs 驯化 p<0.0001；野生内陆 vs 驯化 p=0.003）。野生大西洋以长花丝型为主（94%），性别比例（Srt，雄性不育个体百分比）仅6%；野生内陆Srt为58%；驯化组Srt高达86%。在祖先类别上，北大别与地中海（p<0.001）、北大别与杂交（p<0.0001）在雄花序类型上差异显著，而地中海与杂交无显著差异。
Individual heterozygosity（个体杂合度）
个体杂合度在种质类别（p<0.001）、祖先类别（p<0.001）和雄花序类型（p=0.011）上均存在显著拟合差异。野生大西洋杂合度最低（均值0.55），野生内陆（0.62）和驯化组（0.69）较高；北大别杂合度最低（0.55），杂交最高（0.65）；雄性不育个体杂合度（0.65）高于雄性可育个体（0.59）。
Fruit set（坐果率）
仅雄花序类型（雄性可育 vs 雄性不育）对坐果率（Ppol）有显著影响（p=0.01），雄性不育个体坐果率（0.82）高于雄性可育个体（0.74）。种质类别和祖先类别间无显著差异。
Number of female inflorescences per bisexual catkin（每个两性花序中的雌花序数量）
祖先类别（p=0.009）和雄花序类型（p<0.001）对此性状影响显著，种质类别不显著（p=0.072）。地中海种质均值最高（5.2），其次为杂交（2.8）和北大别（2.2）；雄性不育个体比雄性可育个体多88%（3.61 对比 1.92）。
Male catkin length（雄花序长度）
雄花序长度在野生和驯化数据集中均随雄性育性降低而显著减小（p<0.001），分为雄性不育、部分雄性不育和雄性可育三类有显著差异。野生散种树集合的解释率（R2）达31.5%，嫁接品种集合为8.7%。
讨论与结论总结
对加利西亚西北部野生大西洋、野生内陆和驯化欧洲栗种质组数据的分析揭示了祖先、雄性不育、杂合度、坐果率及雌雄性花生产方面的显著差异。尽管使用的SSR数量较少，但研究人员认为结合物候学知识，8个SSR的祖先分配与现实具有高度对应关系。
在野生大西洋组中占主导的北大别祖先种质被认为是该地区的自然本土欧洲栗，其雄性不育频率仅6%。由于历史上大西洋加利西亚的果园规模较小且驯化程度较低，本地品种常直接选自本土种群，使得该区域的祖先演化结构得以保存，如Eume自然公园同时存在废弃嫁接园与自然种群，均为北大别祖先，关键栽培品种‘Laruda’为同一遗传起源的雄性可育基因型。在内陆加利西亚的高海拔地区，仍栽培着如‘Amarelante’和‘Longal’等具有北大别祖先、雄性不育且晚萌动的古老品种，可能代表了地中海种质人为迁移和扩张之前存在的本土自然种群残余。
欧洲栗在内陆加利西亚的驯化主要由雄性不育的选择驱动（35个品种中31个雄性不育），且品种选择倾向于增加北大别与地中海种群间的杂交祖先（35个品种中24个为种内杂交）。雄性不育个体的功能优势似乎是欧洲栗驯化综合征的基石。雌性优势通过两种互补机制实现：一是资源再分配，雄性不育个体每个两性花序几乎多产两倍的雌花序（3.6 对比 1.9），节省的雄蕊发育和花粉生产能量可能转向坚果生产；二是效率提升，雄性不育种质坐果率更高（0.82 对比 0.74），证实其在将花转化为成熟栗苞方面更高效。杂种优势（Heterosis）代表驯化综合征的另一组件，对种内杂交种质的偏好似乎由其增加的杂合度驱动，雄性不育种内杂交个体杂合度（0.65）显著高于雄性可育个体（0.59）。因此，西北部的驯化在很大程度上由对雄性不育、种内杂交祖先和高杂合度等性状的无意选择组成，这些与更高坚果产量相关。雄性不育、杂交祖先、高杂合度，连同更高坐果率、更高雌花序密度和更短雄花序，构成了欧洲栗明确的驯化综合征。
内陆加利西亚的祖先特征以中间基因型为主，类似于弱基因流屏障下的单模杂交带，但此结构不仅反映自然过程，也源于人源混合。地中海栽培品种的引入可能促进了种内杂交个体的增加，这种动态可能从10世纪起随着Sil和Mi?o山谷栗树栽培的建立而加剧。‘Rapada’中间型品种似乎是地中海种质向南北内陆扩散的主要载体，其广泛用于果园促进了与缺乏合适育性恢复基因的本地北大别种质的杂交，产生了更高程度雄性不育的后代。北部内陆地区比南部观察到更高的地中海种质渐渗，可能与南部高海拔果园孤立地持续保留传统北大别品种有关。
长期栽培雄性不育基因型导致了野化（Exoferal）种群的出现，这些种群是地中海种质及其种内杂交在自然化过程中与内陆加利西亚类型并存的遗传马赛克。与冰期避难所种群不同，这些常与嫁接品种混合的野化林分表现出极高的性别比例（51.5%至73.1% 对比 自然大西洋种群6.1%）和比野生大西洋种质更高的杂合度（0.62 对比 0.55）。野化种群充当具有理想生产性状的自然化基因型储库，通过选择和嫁接成为新品种来源；同时果园主要通过种子介导的基因流向景观贡献新的雄性不育个体。在古老品种占主导的区域，多数野化树木共享相同的母本（栽培的古老品种）。内陆加利西亚的基因库数个世纪以来充当驯化实验室，针对坚果生产的强烈选择使种群结构向雄性不育转变。虽然这些品种受益于更高坐果率，但长花丝个体的急剧减少（驯化组性别比例0.86）表明高度依赖有限的有效花粉供体，如‘Negral’等雄性可育品种是关键繁殖锚点。由于父权研究指出长花丝树提供了绝大多数有效花粉，这些人为系统的稳定性取决于保持高产不育栽培品种与关键授粉基因型之间的功能平衡。欧洲栗在内陆加利西亚的案例说明了人源基因流如何导致野化近缘种深刻的结构变化，且由于此类栽培方法广泛存在，伊比利亚西北部其他地区的变异模式可能与此类似。
雄性功能减退常表现为特定形态改变而不改变整体花架构，包括花丝缩短、无法展开、花粉败育或非裂开棕色花药。雄性不育个体通常每个枝产更多雌花序，此性状是雌性优势的直接组件，可能与增产潜力相关；在某些情况下，这种转变通过同源异型（Homeosis）——特别是雌蕊同化（雄蕊转变为雌蕊状结构）表现为花架构的全局改变。四种雄花序类别代表雄性育性降低的连续体，变异通常发生在相邻类别间；长花丝和缺花药型保持稳定，短花丝种质可塑性最大。尽管如此，结果突出了雄性可育与雄性不育类型间的明确功能分界，特别是在杂合度、每个两性花序雌花序数和坐果率方面。但目前保留四类系统仍是必要的，直到更全面了解生殖行为的具体功能。
综上所述，此项研究证明西北伊比利亚数个世纪的欧洲栗驯化从根本上由朝向雌性生殖成功的功能转变驱动。这种雌性优势由选择具有高个体杂合度的种内杂交个体、减少对雄花生产的投入并增强坐果率支撑。野生树木中资源的显著再分配（雌花增加近两倍）也是驯化栗品种中可能存在的性状。研究结果表明，该区域当前遗传景观不仅是自然冰后定殖的产物，更是人源马赛克，其中野化种群充当驯化的活跃实验室。通过整合遗传、形态学和历史数据，研究人员定义了欧洲栗明确的驯化综合征，以雄性不育和高杂合度为特征，并通过数个世纪的传统嫁接实践稳定。这些结果强调了保护未受驯化影响的 Atlantic 种群及果园中古老品种的重要性。
