用于骨感染治疗的抗菌与再生性铜掺杂杂化生物材料

《Drug Delivery and Translational Research》：Antimicrobial and regenerative copper-doped hybrid biomaterials for bone infection treatment

　　

骨组织具有内在再生能力。然而，在创伤、肿瘤病灶手术切除及感染等重大损伤情况下，这种能力会受到破坏。骨髓炎（OM）是一种骨组织感染性疾病，主要由革兰阳性菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）引起，其特征为广泛的组织重塑与炎症反应。局部及全身抗菌治疗是当前标准治疗方案；然而，其疗效常因免疫介导的血管损伤以及生物被膜（biofilm）形成而受到限制。负载抗菌成分的生物材料因此成为一种有前景的替代策略。在这方面，由生长于胶原纤维上的羟基磷灰石纳米晶构成、模拟骨细胞外基质的杂化支架，已被证明能够支持细胞功能并随时间逐步吸收降解。此外，这类材料还可掺入具有生物活性和抗菌作用的离子，并在支架降解和组织再生过程中以可控且持续的方式释放这些离子。

本研究将Cu²⁺掺杂羟基磷灰石引入胶原支架（Col/CuHA）中，旨在开发一种能够同时预防/治疗骨感染并促进组织再生的生物材料。这些基质重现了骨组织的结构特征，并可释放对生物被膜形成型金黄色葡萄球菌分离株具有杀菌活性的Cu²⁺离子。在模拟动态液体交换条件的体外实验中，研究人员确定了兼具抗菌活性与细胞相容性的最佳Cu²⁺负载量。来自小鼠异位支架植入模型的初步体内观察提示，这些生物材料能够整合入宿主组织，从而进一步证实了在所采用Cu²⁺负载水平下其具有生物相容性。研究结果表明，Col/CuHA支架是用于预防和/或治疗骨髓炎并促进骨修复的有前景候选材料，并提示其有望成为传统抗生素策略之外的一种创新性替代方案。

该论文发表于《Drug Delivery and Translational Research》，聚焦骨感染尤其是骨髓炎（osteomyelitis，OM）治疗中“抗感染”与“促再生”难以兼顾的核心临床问题。骨组织虽然具有一定的内在再生潜能，但在严重创伤、肿瘤切除及感染等情况下，这种能力明显受损。当前OM治疗通常依赖外科清创联合长期全身抗生素治疗，但由于感染部位局部血供不足、生物被膜（biofilm）形成以及骨组织本身解剖和生理特点限制，系统给药常难以在病灶处达到稳定有效浓度。同时，长期抗生素治疗还伴随系统毒性、耐药性增加以及治疗周期长等问题。对于清创后遗留的“死腔”，临床上常需植入聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）等间隔材料，但其不可降解，需要二次手术取出，进一步增加再感染和并发症风险。因此，开发一种既能局部持续抗菌、又能支持骨修复、并可在体内逐步降解的植入性材料，具有明确临床意义。

在这一背景下，研究人员构建了胶原/铜掺杂羟基磷灰石杂化支架（Col/CuHA）。该设计建立在仿生矿化（biomineralization）理念之上：以I型胶原（type I collagen）作为有机骨架，在其表面及纤维内部原位生成铜掺杂羟基磷灰石（Cu-doped hydroxyapatite，CuHA）纳米晶，从而尽可能模拟天然骨细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的组成与层级结构。研究的理论基础在于，Cu²⁺兼具抗菌活性和一定生物学功能，可作为局部抗菌离子来源；但过高浓度Cu²⁺又可能诱导细胞毒性，因此需要在“足够杀菌”和“维持细胞相容性”之间实现平衡。研究人员据此设置0.5、1和2 mol%三种铜掺杂水平，系统评估其理化性质、Cu²⁺释放动力学、对金黄色葡萄球菌的抗菌作用、对成骨前体细胞的细胞相容性，以及初步体内宿主反应。

主要技术方法概括：研究采用仿生矿化法制备30/70质量比的Col/CuHA多孔支架，经冷冻干燥和脱氢热处理（DHT）交联成型；利用环境扫描电子显微镜（ESEM）、电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）、X射线衍射（XRD）、热重分析（TGA）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）及力学测试表征材料结构与性质；以金黄色葡萄球菌分离株和小鼠成骨前细胞MC3T3-E1开展体外抗菌与细胞相容性实验，并设计动态预处理模型模拟体内液体交换；最后在C57BL/6J小鼠皮下异位植入模型中进行1周初步组织学评价。

Morphological characterization of the scaffolds
研究人员首先通过ESEM观察支架形貌，证实所有样品均具有高度多孔、纤维化且三维互联的结构。羟基磷灰石颗粒紧密结合于胶原纤维表面，并部分嵌入较大的自组装纤维内部，说明仿生矿化过程成功形成层级化复合结构。总孔隙率超过85%，其中大孔占比至少53%，有利于液体渗透、细胞浸润和组织长入。不同铜掺杂水平未明显改变支架宏观和微观结构，说明掺铜过程未破坏其仿骨架构。

Chemical properties of the Col/CuHA biomaterials
ICP-OES结果显示，所有矿物相的（Cu+Ca）/P比值均低于化学计量羟基磷灰石的1.67，提示材料结晶度较低、接近天然骨矿物特征。随着Cu²⁺掺入增加，Ca/P比下降，说明Cu²⁺有效替代了晶格中的Ca²⁺。XRD进一步证实支架形成了纯磷灰石相，未见明显次生晶相；衍射峰宽且不尖锐，表明晶体尺寸纳米化且结晶度低。TGA测得矿物相质量分数约为58%–59%，即实际Col/CuHA质量比约为40/60，并提示矿化过程中存在少量矿物损失。FT-IR同时检测到胶原酰胺带和羟基磷灰石磷酸根特征峰，证明有机相与无机相在同一支架内成功整合。

Physical and mechanical characterization of the Col/CuHA scaffolds
在PBS中，所有支架均表现出快速吸水膨胀能力，30 min内达到平衡，吸液率约为初始质量的320%–370%，说明其具有较强亲水性，可模拟天然骨微环境中的液体通透特征。降解实验显示，支架在28 d内失重不足5%，整体三维结构保持稳定，表明DHT交联赋予了材料良好的结构稳定性。压缩力学测试显示，湿态压缩模量约为30–35 kPa，各组之间无显著差异，说明Cu²⁺掺杂并未削弱材料在生理湿态下的基本力学完整性。虽然其模量显著低于天然骨，但足以支持细胞定植和组织替代的早期支架功能。

Evaluation of the antimicrobial properties and cytocompatibility of the Col/CuHA scaffolds
在抗菌性能方面，研究人员以甲氧西林敏感、具生物被膜形成能力的金黄色葡萄球菌为模型菌株，采用菌落形成单位（CFU）计数评估支架表面存活菌数。结果显示，与无铜支架相比，所有掺铜支架均在多数时间点降低了细菌存活，且在48 h与72 h时表现出一定剂量依赖性，其中Col/CuHA_2抗菌效果最强。说明Cu²⁺释放能够对骨髓炎常见病原菌产生抑制作用。

然而，在细胞相容性方面，直接将MC3T3-E1细胞接种于支架表面的3D培养实验显示，掺铜支架均表现出不同程度的细胞毒性，尤其是Col/CuHA_2最为明显。进一步在2D体系中用支架条件培养基处理细胞后发现，1 h条件培养基仅Col/CuHA_2具有明显毒性，但24 h条件培养后，所有掺铜组均降低了细胞活性。这表明支架初始阶段Cu²⁺快速释放虽有利于抗菌，但同时会抑制成骨相关细胞存活，提示必须优化铜释放过程。

Preconditioning of Col/CuHA scaffolds
为更接近体内植入后的液体交换环境，研究人员设置了支架预处理模型，使支架在培养基中预先释放Cu²⁺一段时间，以评估不同阶段抗菌与细胞相容性的动态平衡。该设计并非模拟未来临床操作必须进行的支架预处理，而是作为一种体外简化策略，用于考察材料在植入后随时间推移的性能演变。

Release of copper ions into the cell culture medium
ICP-OES分析表明，Cu²⁺释放呈现明显的“双阶段”特征：在过夜至24 h阶段出现初始爆发释放（burst release），随后释放速率逐渐下降。总释放量随铜掺杂比例增加而增加，但在168 h后，约85 wt%的初始Cu²⁺仍保留在支架内，提示嵌入胶原内部的CuHA颗粒可作为长期离子储库。该结果说明支架既具备早期高强度局部抗菌潜力，也可能在后续降解过程中持续提供低水平Cu²⁺。

Evaluation of the antimicrobial activity and cytocompatibility of Col/CuHA scaffolds after prior release of Cu²⁺
经不同时间预处理后，Col/CuHA支架仍保留一定抗菌活性，但表现出明显配方差异。Col/CuHA_2在所有预处理时长下均能稳定抑制细菌生长；Col/CuHA_1在较短预处理后仍有抗菌作用；Col/CuHA_0.5则在过夜预处理后基本失去显著抗菌性。与之相对应，细胞相容性在预处理48–72 h后明显改善：Col/CuHA_1和Col/CuHA_2由早期细胞毒性状态转为可被MC3T3-E1细胞接受，说明随着初始高浓度Cu²⁺释放结束，材料逐步进入更适于细胞黏附和生长的阶段。补充基因表达分析显示，预处理后条件培养基对成骨分化相关基因总体影响有限，但Col/CuHA_2可下调Vcam并上调Atp7b，提示较高铜暴露仍可能对细胞黏附功能及铜离子解毒反应产生影响。

In vivo studies in a mouse model
在小鼠皮下异位植入的初步体内实验中，所有动物在1周观察期内总体状态良好，提示材料未引起明显全身毒性。组织学结果显示，无铜对照Col/HA支架与宿主组织整合较好，并可见单核-巨噬细胞系炎症细胞浸润及纤维蛋白网络形成。随着铜含量升高，细胞浸润程度降低，宿主反应发生变化。尤其Col/CuHA_2组可见较多凋亡细胞及纤维包膜形成，提示高铜负载可能引起局部细胞毒性并诱导隔离性宿主反应。相比之下，低铜和中铜支架表现出更可接受的短期组织耐受性，为后续优化提供了方向。

Visualization of SA and MC3T3-E1 cells cultured on Col/CuHA scaffolds
ESEM共培养观察进一步支持该材料的“两阶段机制”。在Col/CuHA_1支架预处理48 h后，若先接种金黄色葡萄球菌，可观察到细菌结构明显受损，提示仍存在有效抗菌作用；之后再接种MC3T3-E1细胞，则可见细胞在矿化纤维上铺展并进入孔隙内部。若在较晚时间点共同接种细菌和细胞，两者形态均较完整，而单独在96 h和168 h后接种细胞时，细胞表现出更明显的定植与扩展。该结果与活性检测共同表明，支架在早期偏向抗菌，随后逐步恢复对细胞友好的再生微环境。

综合讨论表明，本研究成功构建了仿生Col/CuHA杂化支架，并通过材料结构设计实现了Cu²⁺的可控释放。其核心贡献在于提出并验证了一种兼顾抗感染与组织再生的时间序列策略：植入早期依靠Cu²⁺爆发释放实现高效局部抗菌，抑制金黄色葡萄球菌定植；随后随着Cu²⁺释放速率下降，材料细胞相容性逐渐改善，从而支持宿主细胞浸润和组织修复。研究也清楚表明，铜负载过高会加剧细胞毒性和不良宿主反应，因此后续转化应用的关键在于进一步精细调控铜掺杂量与释放动力学。作者同时指出，本研究尚未直接进行生物被膜定量检测，动物实验样本量较小且仅设单一短期终点，因此仍需在感染性骨缺损或骨髓炎模型中开展更系统验证。

研究结论部分可译为：
本研究构建了含铜掺杂羟基磷灰石的仿生胶原基杂化支架，旨在将抗菌活性与骨组织再生潜能相结合。所得Col/CuHA生物材料能够以可控方式释放Cu²⁺离子，并对金黄色葡萄球菌产生抗菌作用，后者是骨髓炎的主要致病菌之一。研究结果强调，必须谨慎平衡抗菌效力与细胞相容性，因为Cu²⁺离子的初始爆发释放与成骨细胞毒性相关。然而，在支架经预处理及离子逐步释放后，材料细胞相容性得到改善，同时部分保留抗菌活性，提示有可能随时间推移实现感染控制与组织再生之间更有利的平衡。初步体内观察进一步提示，这些支架可被宿主组织耐受并整合于植入部位，尽管在较高Cu²⁺浓度下观察到局部炎症反应和细胞毒性迹象。这些发现表明，未来转化应用必须优化铜负载量及其释放动力学。总体而言，现有结果支持铜掺杂胶原/羟基磷灰石杂化支架作为骨感染管理多功能生物材料候选者的潜力。所提出的“两阶段机制”——即初始抗菌阶段后逐步改善的细胞相容性阶段——可能代表一种有前景的骨髓炎预防与治疗策略。但在进入临床转化之前，仍需在具有临床相关性的感染性骨缺损模型中，进一步系统评估其长期生物相容性、成骨性能与抗菌有效性。