《Histochemistry and Cell Biology》：Visualisation of peroxisomes: a journey through seven decades
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过氧化物酶体是普遍存在于真核生物中的氧化性细胞器，在细胞脂质代谢与氧化还原平衡维持中发挥保守功能。当前学界已将其视为具有重要医学意义的核心代谢细胞器，参与抗病毒信号传导、病原体防御、先天免疫、癌症及神经退行性疾病等生理病理过程。研究人员对过氧化物酶体生物学特性
过氧化物酶体是普遍存在于真核生物中的氧化性细胞器，在细胞脂质代谢与氧化还原平衡维持中发挥保守功能。当前学界已将其视为具有重要医学意义的核心代谢细胞器，参与抗病毒信号传导、病原体防御、先天免疫、癌症及神经退行性疾病等生理病理过程。研究人员对过氧化物酶体生物学特性、分子功能及其在疾病中作用机制的认知，源于生物化学与形态学研究方法的协同发展。本综述系统梳理了过去70年间针对哺乳动物、酵母及植物中过氧化物酶体特异性标记、识别与可视化的形态学技术与方法体系，追溯了从早期细胞化学与电子显微镜技术到现代荧光成像及高分辨率技术的演进历程，阐明了各类成像策略推动过氧化物酶体生物学发展的历史贡献，旨在将当前过氧化物酶体可视化技术置于历史与方法学的双重语境中进行阐释。
引言
过氧化物酶体（peroxisomes）是具单层膜结构的氧化性细胞器，基质呈细颗粒状，普遍存在于几乎所有真核生物中。自70年前被发现以来，其高度可塑的动态特性、对环境变化的响应能力及在生命健康与疾病中的重要作用始终吸引着研究人员的关注。作为核心代谢细胞器，过氧化物酶体在细胞脂质代谢与氧化还原平衡维持中发挥关键作用：哺乳动物的过氧化物酶体参与复杂脂肪酸（如支链脂肪酸、极长链脂肪酸）的α-和β-氧化（线粒体β-氧化无法降解此类底物）、醚磷脂（如髓鞘所需成分）合成、胆汁酸及多不饱和脂肪酸（如视网膜与脑的重要膜成分二十二碳六烯酸DHA）合成，以及嘌呤、多胺、乙醛酸与氨基酸代谢。不同物种、组织甚至细胞的过氧化物酶体功能存在显著异质性：丝状真菌的过氧化物酶体参与抗生素（如青霉素）及其他次级代谢产物合成；植物过氧化物酶体含乙醛酸循环，可将脂肪酸转化为碳水化合物（如种子与幼苗中的乙醛酸循环体），并参与植物激素（如茉莉酸）生物合成、光呼吸及活性氧（ROS）代谢；锥虫的过氧化物酶体因含糖酵解酶被称为糖酵解酶体（glycosomes）。除代谢功能外，过氧化物酶体还在细胞应激抵抗、健康衰老、病原体防御及免疫反应调控中发挥保护作用，已成为现代细胞生物学与生物医学的研究焦点。
过氧化物酶体的显著特征是其增殖能力，可随代谢物（如脂肪酸）或化学物质（如降脂药、邻苯二甲酸酯类等“过氧化物酶体增殖剂”）发生数量、大小、形状及酶组成的动态变化。其生物发生依赖过氧化物酶体生物发生因子——过氧化物酶体蛋白（peroxins, PEX蛋白），由PEX基因编码，最初通过酵母诱变筛选发现。过氧化物酶体可通过膜生长与分裂由已有细胞器产生，也可在特定条件下从头形成，且能导入完全折叠甚至寡聚的蛋白质，其具体机制仍有待阐明。
PEX蛋白缺陷可导致严重的过氧化物酶体生物发生障碍（peroxisome biogenesis disorders, PBDs），引发发育畸形、器官异常及神经功能损伤（如Zellweger谱系障碍ZSDs）：此时过氧化物酶体因无法导入基质蛋白仅存空膜残基（“鬼影”），或完全缺失。此外，单个酶缺陷（single enzyme deficiencies, SEDs）可影响特定代谢通路，如ABCD1（过氧化物酶体ABC转运蛋白）缺陷导致X连锁肾上腺脑白质营养不良。过氧化物酶体还通过调控细胞氧化还原平衡参与细胞衰老、年龄相关疾病、神经退行性疾病及癌症的发生发展。
哺乳动物组织与细胞中过氧化物酶体的可视化
基于特征形态的早期电子显微镜检测
1954年，瑞典显微学家J. Rhodin在小鼠肾近曲小管细胞中首次描述了“微体”（microbody），即过氧化物酶体的雏形。随后电子显微镜在大鼠肝中也观察到含晶状致密核心的微体，后证实该核心为尿酸氧化酶。Christian De Duve团队通过细胞分馏与酶活性测定，证实尿酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶与过氧化氢酶共同定位于一类非溶酶体的胞质颗粒，因含产氢过氧化物的黄素氧化酶及分解过氧化氢的过氧化氢酶，De Duve于1965年将其命名为“过氧化物酶体”。密度梯度离心技术的建立实现了过氧化物酶体的富集与分离，电镜观察显示其常含尿酸氧化酶的结晶核心。不同哺乳动物物种的过氧化物酶体存在形态异质性，如牛肾皮质过氧化物酶体的边缘板（marginal plates）由α-羟基酸氧化酶B组成，赋予其棱角状外形。冷冻断裂与冷冻蚀刻技术进一步揭示了过氧化物酶体膜的颗粒特征及其与内质网（ER）的紧密关联。
基于过氧化氢酶DAB细胞化学的特异性染色
首个过氧化物酶体特异性染色方法基于3,3'-二氨基联苯胺（DAB），利用过氧化物酶体中过氧化氢酶的过氧化物酶活性，在碱性pH、高温及高浓度过氧化氢条件下，DAB氧化形成电子致密的不可溶性聚合物，可通过电镜或光镜（呈棕褐色沉淀）观察。该方法证实了过氧化物酶体在真核细胞中的普遍性，并在人类Zellweger综合征患者的肝肾组织中检测到过氧化物酶体缺失，成为过氧化物酶体病诊断的核心技术，同时用于定量过氧化物酶体增殖剂诱导的数量与形态变化。
基于铈（Ce）技术的氧化酶活性定位
铈技术通过将铈离子与氧化酶反应生成的过氧化氢结合形成电子致密的铈过氢氧化物，实现过氧化物酶体氧化酶活性的定位。优化方案需加入叠氮化钠抑制过氧化氢酶，并使用PIPES或Tris-HCl缓冲液。该方法证实尿酸氧化酶、D-氨基酸氧化酶等H2O2生成酶定位于过氧化物酶体内，揭示同一组织甚至同一细胞内过氧化物酶体的酶学异质性，如发现大鼠肝小叶不同区域、再生肝中过氧化物酶体的氧化酶活性差异，以及过氧化物酶体可呈球形、管状等多种形态并与ER紧密接触，为过氧化物酶体生物发生研究提供了形态学依据。
免疫标记技术定义细胞器身份与功能
随着过氧化物酶体标志蛋白（如过氧化氢酶、氧化酶、PEX蛋白、ABCD转运蛋白）的抗体制备技术发展，免疫电镜与免疫荧光技术成为研究主流。免疫金标记技术可精确定位过氧化物酶体基质与膜蛋白的分布，证实结晶核心的组成，揭示过氧化物酶体基质的区室化特征；在临床研究中，该技术用于诊断过氧化物酶体病，如检测Zellweger综合征患者细胞中的“过氧化物酶体鬼影”，并通过回补功能性PEX蛋白验证缺陷基因。免疫标记还用于验证蛋白质组学发现的新型过氧化物酶体蛋白，揭示不同细胞类型中过氧化物酶体蛋白组成的异质性。
荧光融合蛋白与过氧化物酶体靶向信号的活细胞成像
绿色荧光蛋白（GFP）的发现与过氧化物酶体靶向信号（PTS1：C端三肽S/A/C-K/R/H-L/M；PTS2：N端序列）的鉴定，使活细胞过氧化物酶体动态观测成为可能。GFP-PTS1融合蛋白可特异性标记过氧化物酶体，揭示其在微管上的运动特性、与ER的接触（由ACBD5与VAP蛋白介导）及管状/网状结构的动态变化。MIRO1蛋白被证实调控过氧化物酶体的运动与膜动力学，而过氧化物酶体突起（peroxules）的发现则提示细胞器间通讯的新机制。光遗传学工具、自动化图像分析及数学建模进一步推动了过氧化物酶体定位与动力学的定量研究。此外，荧光探针还可用于检测过氧化物酶体的pH、氧化还原状态、钙信号及pexophagy过程，split-GFP/SPLICS等技术则用于研究细胞器 proximity 与蛋白拓扑结构。
非遗传标记活细胞成像探针
除遗传编码的荧光融合蛋白外，研究人员开发了肽类PTS1荧光探针、荧光脂肪酸偶联物（如PeroxiSPY650、PeroxiSPY555）等非遗传标记工具，可在数分钟内标记活细胞过氧化物酶体，适用于难以转染的细胞或组织。这类探针通过ABCD1-3转运蛋白进入过氧化物酶体，也可标记斑马鱼胚胎中的过氧化物酶体，但不标记植物过氧化物酶体，体现了不同物种过氧化物酶体底物特异性的差异。
超分辨率显微镜突破衍射极限
超分辨率显微镜（SRM）技术（如单分子定位显微镜SMLM、受激发射损耗显微镜STED）将过氧化物酶体成像分辨率提升至纳米级，揭示了过氧化物酶体基质与膜蛋白的区室化分布、Zellweger综合征“鬼影”的亚衍射表型、缺血脑中过氧化物酶体生物发生动态，以及病毒侵染过程中过氧化物酶体-ER接触的重构。在酵母中，SRM还追踪到Pex3与自噬受体Atg30的定位动态变化。
酵母细胞中过氧化物酶体的可视化
酵母过氧化物酶体概述
酵母过氧化物酶体参与脂肪酸β-氧化、乙醛酸循环、甲醇代谢及脂质与氨基酸合成，其大小与数量受碳源严格调控：甲醇、油酸、甲胺等诱导增殖，葡萄糖与乙醇则触发降解。酵母（如酿酒酵母、Hansenula polymorpha、Pichia pastoris）是研究过氧化物酶体功能与生物发生的经典模型，其遗传可操作性支持通过突变体筛选鉴定PEX基因，目前已发现39个PEX基因参与过氧化物酶体生物发生。
DAB细胞化学与诱导型过氧化物酶体的发现
酵母过氧化物酶体最早通过电镜在葡萄糖培养的酿酒酵母中发现，DAB染色证实其含过氧化氢酶活性。由于酵母细胞壁阻碍DAB渗透，超薄冷冻切片技术显著提升了标记效果。DAB染色显示，烃类或甲醇培养的酵母过氧化物酶体增大、过氧化氢酶活性升高，且酶定位模式随碳源变化：甲醇培养时集中于结晶核心，烃类培养时均匀分布于基质。该技术还用于鉴定过氧化物酶体生物发生缺陷突变体的结构异常。冷冻断裂与DAB结合的技术进一步解析了过氧化物酶体膜的拓扑结构。
铈细胞化学解析过氧化物酶体结构
铈技术成功定位了甲醇酵母中酒精氧化酶的活性，揭示其结晶核心的超微结构；在甲胺为氮源的酵母中定位胺氧化酶，在尿酸利用酵母中定位尿酸氧化酶，证实了过氧化物酶体功能与结构的底物特异性适应。
免疫标记解析蛋白导入与功能
免疫金标记用于定位酵母过氧化物酶体的基质酶（如酒精氧化酶、硫解酶）与膜蛋白，区分导入缺陷与过氧化物酶体缺失突变体，证实PEX基因的功能。例如，Pex3p或Pex19p缺陷导致过氧化物酶体组装失败，Pex1p缺陷则形成无基质的“鬼影”。抗体标记还揭示了PTS1与PTS2途径的蛋白导入机制。
荧光融合蛋白揭示动态、遗传、从头形成与细胞器接触
GFP-SKL融合蛋白实现了酵母过氧化物酶体的活细胞标记，发现其分裂依赖发动蛋白相关蛋白Vps1p与Dnm1p，且通过肌动蛋白细胞骨架与Myo2p马达向子细胞定向运输，Inp2p作为衔接蛋白确保过氧化物酶体正确遗传。高通量筛选利用GFP-PTS1鉴定了大量过氧化物酶体生物发生相关因子。GFP标记Pex蛋白还揭示了过氧化物酶体可从ER从头形成，随后通过生长与分裂增殖；双分子荧光互补（BiFC）技术则发现了过氧化物酶体与线粒体、液泡的接触位点及其在脂肪酸β-氧化中的功能。
植物细胞中的过氧化物酶体可视化
植物过氧化物酶体概述
植物过氧化物酶体功能更为多样，除参与脂质分解、光呼吸、ROS代谢外，还合成茉莉酸、生长素等激素，并响应盐、旱、重金属等非生物胁迫。与酵母类似，植物脂肪酸β-氧化仅发生于过氧化物酶体，种子萌发期依赖其将储存脂质转化为碳水化合物。光呼吸过程中，过氧化物酶体与叶绿体、线粒体协作回收磷酸乙醇酸，防止碳损失。过氧化物酶体还与ER、叶绿体、线粒体形成代谢网络，参与植物-病原互作。
DAB细胞化学揭示过氧化物酶体转换
DAB染色证实植物过氧化物酶体含过氧化氢酶活性，并追踪到种子萌发过程中乙醛酸循环体（glyoxysomes）向叶过氧化物酶体的转换：蓖麻胚乳中乙醛酸循环体在萌发早期增殖以动员脂质，光合启动后转变为过氧化物酶体；豌豆叶片衰老过程中过氧化物酶体数量随ROS积累而增加。
亚铁氰化物细胞化学标记乙醛酸循环体
亚铁氰化物法通过标记乙醛酸循环体特有的苹果酸合酶，区分乙醛酸循环体与过氧化物酶体，揭示黄瓜子叶中两类细胞器可共存于同一微体群，随发育阶段发生功能转换。
铈技术定位氧化酶
铈技术成功定位植物过氧化物酶体中的乙醇酸氧化酶与尿酸氧化酶，灵敏度高于DAB法，尤其适用于根瘤菌侵染细胞中的小型过氧化物酶体。
免疫标记表征乙醛酸循环体
植物细胞壁与内源性免疫球蛋白结合干扰是免疫标记的主要挑战，通过酶解细胞壁、预免疫血清封闭及低温树脂包埋（如Lowicryl、LR White）可克服。免疫金标记证实乙醛酸循环体在萌发过程中转变为过氧化物酶体，反之亦然；还定位了过氧化氢酶在结晶包含体中的分布，以及根瘤特异性尿酸氧化酶、胁迫诱导的过氧化物酶体通道蛋白等。
荧光融合蛋白与生物传感器揭示动态与理化性质
GFP-PTS1/PTS2融合蛋白实时显示植物过氧化物酶体呈球形或管状，沿肌动蛋白细胞骨架运动，在有丝分裂时聚集于细胞板，并受ROS诱导形成管状突起（peroxules）与其他细胞器互作。钙传感器Cameleon、BiFC技术及sfGFP（superfolder GFP）系统分别用于检测过氧化物酶体钙信号、蛋白互作及蛋白导入机制。光转换荧光蛋白Kaede可追踪过氧化物酶体的融合与分裂，mNeonGreen与mRuby3双标记则揭示了过氧化物酶体腔内囊泡的存在。小分子探针如BODIPY衍生物可用于活体监测盐胁迫下的过氧化物酶体增殖。
超分辨率显微镜的应用前景
植物过氧化物酶体超分辨率成像仍处于起步阶段，ROOT-ExM（植物根膨胀显微镜）、ClearSee组织透明化及结构光照明显微镜（SIM）等技术有望在未来解析其纳米级结构与动态。
结论
过氧化物酶体作为核心代谢与信号细胞器，其功能多样性与动态特性通过成像技术的革新得以逐步揭示。从早期细胞化学与电镜到现代荧光成像、超分辨率技术及AI辅助图像分析，各类方法共同推动了对过氧化物酶体生物发生、异质性、细胞器通讯及疾病机制的认知。未来，随着成像技术与分子工具的进一步发展，过氧化物酶体的奥秘将持续被破解，为相关疾病治疗提供新靶点。
