亚甲蓝（Methylene blue, MET）与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）对内毒素（LPS）诱导的急性脑损伤的评价：在大鼠内毒素血症模型中对其神经炎症、氧化应激及血脑屏障（BBB）完整性的影响

《Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology》：Assessment of methylene blue and NAD on LPS-induced acute brain injury: effects on neuroinflammation, oxidative stress, and blood–brain barrier integrity in a rat endotoxemia model

　　

脓毒症诱导的脑功能障碍仍是一项重大挑战，治疗选择有限，因此有必要探索多靶点方法。亚甲蓝（MET）是一种吩噻嗪衍生物，具有增强线粒体和调节电子传递链的特性，而烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）是细胞能量代谢和氧化还原反应中的关键辅因子。研究人员在脂多糖（LPS）诱导的脓毒症模型中研究了MET和NAD单独及联合使用的治疗效果。将雄性Sprague-Dawley大鼠（n = 35）随机分为五组：对照组、LPS（8 mg/kg）组、LPS + NAD（250 mg/kg）组、LPS + MET（15 mg/kg）组以及LPS + NAD + MET组。分析脑组织的氧化应激、炎症和血脑屏障（BBB）完整性。联合治疗在临床参数、抗氧化能力（表现为超氧化物歧化酶水平显著升高，p < 0.001）和大脑组织病理学结果方面表现出最显著的改善。与LPS组相比，它还显著降低了髓过氧化物酶活性（p < 0.001）。MET和NAD单药治疗组的促炎细胞因子IL-6和IL-8均显著降低（p < 0.05），而TNF-α呈下降趋势但无统计学显著性。联合组的脑源性神经营养因子水平维持在与对照组相当的水平，而转化生长因子-β在不同治疗组中表现出差异化调节。免疫组织化学分析显示LPS诱导的血脑屏障（BBB）破坏，表现为闭锁蛋白（occludin）表达减少（p < 0.01），血管周围星形胶质细胞终足中水通道蛋白-4表达增加（p < 0.05），以及原浆星形胶质细胞中神经胶质纤维酸性蛋白反应性升高（p < 0.01）。总之，MET和NAD单独通过减少神经炎症、氧化应激和神经元损伤，对LPS诱导的脑损伤提供了显著保护。联合治疗在某些结果上提供了增量益处。这些发现表明，这两种药物在脓毒症相关脑病（SAE）中可能具有治疗潜力。

研究背景与意义

脓毒症（sepsis）是感染引起的异常宿主反应，可导致多器官衰竭和高死亡率。其中，大脑尤其容易受到脓毒症诱导功能障碍的影响，高达70%的脓毒症患者会出现从谵妄到长期认知障碍不等的神经系统并发症。脓毒症相关脑病（sepsis-associated encephalopathy, SAE）带来了巨大的经济和社会负担，幸存者常经历持续性认知缺陷，降低生活质量并增加医疗成本。目前SAE的病理生理机制涉及全身炎症、氧化应激、线粒体功能障碍和血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）破坏之间的复杂相互作用。细菌成分如革兰氏阴性菌的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）与宿主模式识别受体相互作用，启动炎症级联反应，产生TNF-α、IL-1β和IL-6等细胞因子，这些内毒素引起广泛的免疫激活，导致细胞因子释放失调和内皮功能障碍，从而损害BBB。细胞因子通过BBB完整性降低的区域和迷走神经激活到达大脑，导致神经炎症，涉及小胶质细胞激活、星形胶质细胞增生和活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生，共同促进神经元损伤和突触功能障碍。此外，脓毒症诱导脑组织的线粒体功能障碍，导致能量耗竭、ROS产生增加和凋亡途径激活。BBB破坏已成为SAE的核心机制，促炎介质和氧化应激通过破坏紧密连接蛋白（如occludin和zonula occludens-1）损害BBB完整性。当前SAE的治疗方法主要仍是支持性的，侧重于控制潜在感染、维持脑灌注和避免神经毒性药物，现有干预措施（如右美托咪定、褪黑素）主要靶向单一病理生理机制，且临床试验结果不一致，因此亟需探索多靶点方法。亚甲蓝（methylene blue, MET）作为临床上用于高铁血红蛋白血症的吩噻嗪衍生物，通过改善线粒体功能、减少氧化应激和抑制一氧化氮合酶表现出神经保护作用；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide, NAD）作为细胞代谢的关键辅酶，通过调节氧化应激、炎症和细胞生物能量学发挥作用。尽管二者单独的神经保护证据充分，但其联合应用在脓毒症诱导的脑功能障碍中的潜力尚未被探索。该研究旨在在大鼠LPS诱导的脓毒症模型中，研究MET和NAD单独及联合使用的神经保护效果，假设其联合使用能针对神经炎症、氧化应激和BBB破坏提供 superior 保护，通过临床评分、生化分析和免疫组织化学评估，以开发潜在的多靶点神经保护策略。该论文发表在《Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology》。

主要关键技术方法

研究人员使用35只雄性Sprague-Dawley大鼠（10-12周龄，250-280 g），经伦理批准并按ARRIVE指南饲养。动物随机分为5组（n=7/组）：对照组（生理盐水）、LPS组（8 mg/kg LPS腹腔注射）、LPS + NAD组（LPS后1 h给予250 mg/kg NAD腹腔注射）、LPS + MET组（LPS后1 h给予15 mg/kg MET腹腔注射）、LPS + NAD + MET组（LPS后1 h依次给予NAD和MET，间隔5 min）。采用改良的鼠脓毒症评分（Murine Sepsis Score, MSS）由盲法观察者评估临床参数。LPS给药6 h后麻醉处死，采集脑组织对半分份，一份冻存于-80°C用于生化分析，一份固定于10%中性缓冲福尔马林用于组织病理学和组织化学分析。生化分析包括脑组织匀浆后通过ELISA检测髓过氧化物酶（myeloperoxidase, MPO）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、IL-6、TNF-α、IL-8、NF-κB、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）和转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）水平。组织病理学采用Mallory三色染色评估皮层神经元损伤并进行半定量评分。免疫组织化学检测水通道蛋白-4（aquaporin-4, AQP-4）、神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）、occludin、裂解半胱天冬酶-3（cleaved caspase-3）和NF-κB p65的表达并评分。数据统计使用SPSS 25.0，正态分布采用Shapiro-Wilk检验，方差齐性采用Levene检验，组间比较采用单因素ANOVA（LSD或Games-Howell事后检验）或非参数检验，p < 0.05为差异有统计学意义。

研究结果

概述 of experimental animals and study completion

所有35只Sprague Dawley大鼠均完成实验方案，无脱落或排除。LPS给药后，LPS组动物表现出典型的脓毒症相关临床体征（活动减少、毛发竖立、嗜睡、对刺激反应减弱），对照组行为外观正常，治疗组临床体征表现各异，无意外不良事件或方法偏离。

Effects of treatments on clinical sepsis parameters

LPS给药在所有评估参数中诱导严重的脓毒症临床表现，与对照组相比，LPS处理动物的外观（p < 0.05）、意识（p < 0.05）、活动（p < 0.05）和对刺激的反应（p < 0.05）显著受损。NAD、MET或其联合治疗显著改善这些临床参数，联合治疗（LPS + MET + NAD）的临床参数改善更显著，MSS评分低于单药治疗组（p < 0.05）。

Effects on inflammatory cytokines and NF-κB activation

LPS给药显著增加脑组织促炎细胞因子水平：IL-6水平较对照组显著升高（p < 0.05），MET或NAD单独治疗均显著降低IL-6水平（p < 0.05），联合治疗IL-6水平较LPS组降低但无统计学显著性；IL-8水平LPS组较对照组显著升高（p < 0.05），所有治疗均较LPS组降低IL-8水平（p > 0.05）；NF-κB作为炎症响应关键转录因子，LPS组较对照组显著激活（p < 0.05），两种单药治疗均显著将NF-κB水平降至与对照组相当（p < 0.05），联合治疗也较LPS组降低NF-κB激活但不如单药显著；TNF-α在LPS组较对照组有升高趋势但无统计学显著性（p > 0.05），所有治疗组TNF-α水平与对照组相当。

Effects on oxidative stress and antioxidant parameters

LPS给药较对照组显著增加脑组织MPO活性（p < 0.001），指示中性粒细胞浸润增强和氧化应激，所有治疗方案较LPS组显著降低MPO活性（p < 0.001），联合治疗（LPS + MET + NAD）降低最多，恢复至与对照组相当的水平；LPS单独对SOD水平较对照组影响极小，联合治疗显著升高SOD活性（p < 0.001），较NAD或MET单独表现出更优的抗氧化响应，提示NAD和MET在脓毒症期间增强内源性抗氧化防御的相加效应。

Effects on neuroprotective factors

BDNF作为促进神经元存活的重要神经营养因子，LPS组较对照组有降低趋势但无统计学显著性（p > 0.05），MET单独或联合治疗维持BDNF水平与对照组相当，提示潜在神经保护作用，NAD单独治疗未较LPS组显著改善BDNF水平；TGF-β水平LPS组较对照组升高但无统计学显著性（p > 0.05），治疗组呈中间值，提示对该抗炎细胞因子有调节作用。

Histopathological findings

脑组织组织病理学检查显示组间显著差异：对照组脑组组织学正常，无病理发现；LPS组皮层可见显著神经元损伤，表现为核固缩的神经元坏死、神经元周围空泡化、轻度血管充血、噬神经元作用和卫星现象（胶质细胞增殖围绕受损神经元胞体）；两种治疗组（LPS + MET和LPS + NAD）较LPS组病变显著减少；联合治疗组（LPS + MET + NAD）较单药治疗组改善更明显，病理改变减少。

Immunohistochemical analyses

AQP-4免疫反应性LPS组较对照组显著升高（p < 0.05），MET、NAD?或联合治疗均降低AQP-4表达水平，LPS + NAD（p < 0.05）和LPS + MET + NAD（p < 0.01）较LPS单独显著减弱AQP-4表达，提示潜在相加效应；GFAP作为星形胶质细胞反应性标记物，LPS组较对照组免疫反应性显著升高（p < 0.01），指示星形胶质细胞增生，MET、NAD?单独或联合使用均减少GFAP阳性细胞，仅LPS + NAD组较LPS组统计显著（p < 0.01）；occludin作为紧密连接蛋白，LPS组较对照组显著减少（p < 0.01），指示BBB破坏，治疗组（LPS + MET、LPS + NAD、LPS + MET + NAD）有occludin表达恢复趋势，仅LPS + NAD组较LPS组统计显著改善（p < 0.05），提示NAD在维持BBB完整性中的作用；裂解caspase-3作为凋亡指示，LPS组较对照组轻微升高但无显著差异，治疗组较LPS组也无统计显著变化，提示测试条件下凋亡活性极低；NF-κB p65作为神经炎症关键转录因子，LPS组较对照组核免疫反应性显著升高（p < 0.01），MET治疗（LPS + MET）较LPS组降低NF-κB p65表达，NAD?单独（LPS + NAD）或与MET联合（LPS + MET + NAD）进一步减弱该表达，联合治疗组显著减少（p < 0.001）。

讨论部分总结

SAE影响超50%的脓毒症幸存者，以急性认知障碍和长期神经后遗症为特征，病理生理涉及全身炎症、BBB破坏、神经炎症和氧化应激的复杂交互。本研究使用LPS诱导的内毒素血症模型研究急性神经炎症响应，该模型虽未完全复制临床多微生物脓毒症（单次内毒素而非持续感染），但可靠再现SAE急性脑损伤的关键特征（促炎细胞因子升高、小胶质细胞激活、神经元损伤），结果应解释为反映急性炎症性脑损伤而非SAE全谱。MET和NAD?治疗通过多互补途径抵消LPS诱导的脑损伤：抑制神经炎症、增强抗氧化防御、抑制凋亡、维持BBB完整性。氧化应激和炎症是脓毒症诱导脑损伤的核心，MPO既是标记也是介质，LPS显著增加脑MPO活性，MET、NAD及联合降低MPO活性，联合正常化水平，与既往研究一致。联合治疗较单药显著升高SOD活性，指示相加抗氧化效应：MET通过线粒体电子传递调节减少ROS，NAD通过NAD依赖酶（如SIRT1）支持氧化还原平衡，Hong等显示SIRT1抑制消除NAD的保护效应，Umapati等显示β-NAD通过减少中性粒细胞浸润和调节细胞因子表达减弱LPS诱导炎症。神经炎症在SAE中起关键作用，LPS增加脑IL-6、IL-8、TNF-α并激活NF-κB，MET和NAD单独均减少这些标记，与Park、Fenn、Li等既往研究一致；联合治疗在不同炎症标记中呈差异模式：所有治疗组减少NF-κB激活，但联合未较单药显示更优的细胞因子抑制，甚至MET和NAD单药较联合更有效减少IL-6，提示共给药可能涉及药代动力学或机制交互减弱细胞因子特异性响应，Memis等报道MET改善脓毒症临床参数但不改变细胞因子水平，Cros等提出维持适度细胞因子水平可能通过将巨噬细胞转向抗炎表型改善脓毒症结局，Li等发现NAD前体通过NAD/SIRT1通路减少海马炎症和氧化损伤。本研究关键发现为联合治疗显著改善组织病理学结局和BBB完整性：LPS引起皮层显著神经元损伤，MET和NAD单独减少病变，联合改善最明显，互补神经保护效应；免疫组织化学显示保留紧密连接蛋白和减少神经炎症，LPS增加AQP-4和GFAP免疫反应性并减少occludin，治疗减少这些病理改变，NAD和联合最具显著效应；Ou等将MET抗炎效应联系于抑制Siah2/Morg1/PHD3通路，Li等报道抑制STAT3激活；NAD治疗在occludin表达（p < 0.05）和GFAP减少（p < 0.01）中最一致，联合进一步减弱NF-κB p65表达（p < 0.001），提示两药通过部分重叠机制贡献，Lomniczi等证明MET抑制LPS后iNOS增加防止NO介导的紧密连接破坏，Alam等发现烟酰胺治疗抑制损伤诱导的NF-κB和炎症介质激活同时维持脑突触蛋白。MET的多方面神经保护通过其多通路行动突出，联合治疗恢复occludin表达支持BBB完整性在SAE中的作用，NAD的增强效应可能涉及SIRT1激活，He等发现NMN通过SIRT1/NF-κB通路改善脓毒症诱导的急性肺损伤，Su等报道NMN通过增强GPX4介导的ferroptosis防御抑制小胶质细胞LPS诱导的铁死亡从而抑制神经炎症。MET和NAD联合合理基于互补机制：MET作为替代线粒体电子载体绕过脓毒症诱导的呼吸缺陷并抑制一氧化氮合酶，NAD对细胞修复和能量产生至关重要，通过激活sirtuin依赖通路调节氧化应激和促进线粒体生物发生；两药均有既定临床安全性：MET治疗剂量毒性低，主要不良反应为可逆蓝色变色和G6PD缺乏患者的罕见溶血性贫血；NAD安全性极佳，临床研究仅报告轻微胃肠道症状；联合较单药显示更优抗氧化能力和组织保护（增强SOD活性、减少MPO水平）；两药均已获批多种适应症（MET用于高铁血红蛋白血症，NAD前体用于神经系统疾病），可能促进转化；NAD前体在其他脑损伤模型中也显示一致神经保护效应，NAD在创伤性脑损伤后减少组织学损伤、脑水肿、胶质激活和促炎基因表达，主要通过抑制TLR2/4-NF-κB信号通路；烟酰胺本身在大鼠模型中通过减少梗死体积和维持神经功能保护脑缺血再灌注损伤；这些发现确认线粒体靶向药物和NAD?前体通过互补通路（包括AMPK/PI3K-Akt、NF-κB/MAPK、SIRT1/Nrf2信号）在多种脑损伤中起作用，进一步加强MET和NAD联合用于SAE的依据；维持的BBB完整性与脓毒症患者神经结局差相关；但潜在药物相互作用需考虑，两药可能改变细胞色素P450依赖通路；联合在治疗某些促炎细胞因子方面不如单药的观察是重要发现，可能解释包括两药间药代动力学干扰或特定信号节点的对立效应，需进一步机制研究；70%脓毒症幸存者经历认知功能障碍，本研究可为辅助神经保护策略提供信息，改善生活质量和减少脓毒症后医疗成本。局限性：LPS模型为单次内毒素而非持续感染，未完全复制临床多微生物脓毒症，结果反映急性炎症性脑损伤而非SAE全谱；6 h观察期仅捕获初始炎症响应，无法评估后期事件（持续小胶质细胞激活、进展性BBB破坏、延迟神经元变性）；LPS模型炎症细胞因子峰值更早、消退更快，多微生物模型细胞因子持续更好关联临床疾病严重度；联合在组织病理学氧化应激标记显示增强效应，但单药在减少某些炎症细胞因子更有效，提示互补而非协同效应；未来研究应使用CLP模型、多时间点、生存终点以更好反映SAE的时间进程和复杂性。

结论部分翻译

总之，该研究证明MET和NAD均对LPS诱导的脓毒症相关脑损伤提供神经保护，联合治疗在多个参数中产生增强效应。这些化合物的治疗显著改善临床 manifestatons（通过鼠脓毒症评分评估），尤其联合治疗显示疾病严重度总体降低最显著。这些治疗调节氧化应激（MPO、SOD）、神经炎症信号（NF-κB、IL-6、IL-8和TNF-α）、BBB组分（occludin、AQP-4）以及胶质激活（GFAP）。虽然联合治疗在减少MPO活性、增强SOD水平和改善组织病理学结局方面显示特定获益，但单药治疗在减少某些炎症细胞因子方面更有效。这些发现表明，靶向SAE中不同病理生理机制可能提供治疗获益，但最优治疗策略可能取决于特定临床背景和治疗目标。未来研究应探索高危手术患者的预防性给药以预防SAE发生；此外，研究联合治疗对长期神经可塑性标记的影响将确定增强的线粒体功能是否转化为持续认知保护。