《Neurochemical Research》：A Primary Spinal Cord Mixed Culture Method for In Vitro Analysis of Glial Heterogeneity and Inflammatory Responses
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脊髓研究中传统体外模型常依赖PC-12等简化细胞体系，无法重现脊髓组织的混合细胞环境及胶质-神经元相互作用。虽有原代脊髓培养报道，但多数方案聚焦于纯化细胞群，技术难度高且成本高昂。本研究建立了一种低成本的新生Wistar大鼠原代脊髓混合培养体系，并在体外对其细
脊髓研究中传统体外模型常依赖PC-12等简化细胞体系，无法重现脊髓组织的混合细胞环境及胶质-神经元相互作用。虽有原代脊髓培养报道，但多数方案聚焦于纯化细胞群，技术难度高且成本高昂。本研究建立了一种低成本的新生Wistar大鼠原代脊髓混合培养体系，并在体外对其细胞组成与炎症反应性进行了表征。体外培养第7天，免疫荧光分析显示存在神经元（42.5%）、星形胶质细胞（17.2%）和小胶质细胞（4.4%），另有35.9%未标记细胞群。GFAP阳性星形胶质细胞表现出显著的形态异质性，包括突起型、扁平型和分支型。为检测该体系的炎症反应性，培养物暴露于脂多糖（LPS，5 μg/mL，12 h），导致亚硝酸盐水平升高，阿米巴样细胞增多，Iba1阳性和CD68阳性细胞标记增强。该培养可在体外长期维持，但随着非神经元细胞比例增加，其生物学解释随时间变化。结果表明，该体系可作为易获取的脊髓混合原代平台，用于体外研究胶质相关炎症反应及未来抗炎化合物筛选。
脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）是一种高发病率和高死亡率的疾病，主要影响成人，对全球健康与经济造成深远影响。机械性原发损伤后，继发性损伤级联反应（包括神经炎症、氧化应激和兴奋性毒性）会加剧初始损害并导致永久性功能障碍。星形胶质细胞和小胶质细胞在SCI病理生理中发挥关键作用，前者可形成胶质瘢痕并调控炎症微环境，后者作为中枢神经系统（central nervous system, CNS）常驻免疫细胞，兼具清除碎片与分泌神经营养因子的作用，也可能在过度激活时放大慢性炎症。现有研究多依赖PC-12等简化细胞模型，缺乏脊髓特异性神经化学特征与胶质-神经元交互作用，而原代脊髓培养因取材难度大、产量低且多聚焦运动神经元分离，成本高且操作复杂，限制了广泛应用。因此，开发一种低成本、能保留脊髓混合细胞环境的原代培养体系，对研究胶质异质性及炎症反应具有重要意义。本研究由巴伊亚联邦大学健康科学研究所伦理委员会批准（进程号7326091122），发表于《Neurochemical Research》。
研究人员采用的主要关键技术方法包括：新生Wistar大鼠原代脊髓混合培养制备、脂多糖（LPS）诱导炎症反应模型构建、Griess法检测亚硝酸盐水平评估一氧化氮（nitric oxide, NO）释放、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）定量肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）、免疫荧光染色鉴定神经元（βIII-tubulin、ChAT）、星形胶质细胞（GFAP）和小胶质细胞（Iba1、CD68）标志物、甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）法检测细胞代谢活性，以及ImageJ软件定量分析细胞组成与形态学参数。
研究结果如下：
原代脊髓培养可在体外维持长达90天
培养3小时即可见细胞贴壁，残余组织片段为细胞附着与生长提供物理支持，细胞簇随时间逐渐扩大。相位差显微镜观察显示，培养物在体外可维持至第90天，并保持基本结构完整性。
原代脊髓培养包含多种可识别的细胞群与生长聚集体
体外第7天免疫荧光证实存在神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。定量结果显示，βIII-tubulin和ChAT阳性神经元占42.50%，GFAP阳性星形胶质细胞占17.20%，Iba1阳性小胶质细胞占4.40%，其余35.90%为未标记细胞。神经元在早期培养中更为显著，后期非神经元细胞逐渐占主导。GFAP阳性星形胶质细胞形成广泛纤维网络，βIII-tubulin阳性神经元呈圆形胞体伴细突起，ChAT阳性神经元胞体较大且突起更长。培养中还可见含神经元与星形胶质细胞的混合生长聚集体。
原代脊髓培养中星形胶质细胞呈现形态异质性
GFAP染色显示星形胶质细胞形态多样，包括多边形、扁平煎饼状、高度分支状等，表明该培养保留了星形胶质细胞的表型多样性与可塑性。
LPS对原代脊髓培养的影响
LPS处理12小时呈浓度依赖性降低培养物代谢活性，5 μg/mL和10 μg/mL组显著降低MTT吸光度。相位差显微镜显示阿米巴样细胞增多，细胞束生长模式被破坏。LPS处理组亚硝酸盐水平和TNF-α水平均显著高于对照组，证实炎症反应被有效激活。免疫荧光显示LPS处理后Iba1阳性和CD68阳性细胞数量增加，提示小胶质细胞处于更高活性的吞噬状态。
讨论部分指出，该培养体系保留了脊髓混合细胞环境，避免了简化模型的局限性，但需注意其仅代表脊髓微环境的简化版本，而非完全重现体内继发性损伤的复杂性。星形胶质细胞形态异质性反映了表型多样性，但形态本身不足以证明功能特化。LPS激活的TLR4信号通路可诱导炎症介质释放，但该模型未涵盖血管破坏、外周免疫细胞浸润等体内因素。培养早期（DIV7）适合研究急性胶质反应性，后期则转为胶质主导环境，可用于长期胶质存活与表型变化研究。未标记细胞群可能包含其他非神经元类型，需进一步鉴定。该体系符合3R原则（Reduction, Replacement, Refinement），为抗炎化合物筛选及胶质相关炎症机制研究提供了易获取的平台。
研究结论表明，这种低成本原代脊髓混合培养体系能够在体外保留神经元与胶质细胞的共存环境，有效响应LPS诱导的TLR4介导炎症反应，适用于脊髓损伤相关胶质异质性与神经炎症机制的初步研究，并为未来神经保护策略的开发提供支持。
