含丁香（Eugenia caryophyllus）精油纳米乳的制备及其对变形链球菌（Streptococcus mutans）抗菌与抗生物膜活性的体外与计算机模拟评价

《Odontology》：Development of a nanoemulsion containing essential oil from Eugenia caryophyllus and evaluation in vitro and in silico of its antibacterial and antibiofilm activity against Streptococcus mutans

　　

研究人员开发了丁香（Eugenia caryophyllus）纳米乳并对其抗菌性能与毒性进行了评价。该纳米乳采用高剪切搅拌法制备，油相由精油和表面活性剂组成，水相由表面活性剂与超纯水构成。纳米乳表征指标包括平均液滴直径、ζ电位及多分散指数。抗菌活性通过最低抑菌浓度（MIC）与最低杀菌浓度（MBC）评估，同时检测其对体外及牛切牙标本离体生物膜的清除与抑制能力。计算机模拟毒性预测采用Molinspiration Cheminformatics、pkCSM、ProTox-II及OSIRIS Property Explorer软件完成。分子对接采用AutoDock Vina与AutoDock4 AMDock v.1.5.2分析白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-8、IL-10及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）与丁香酚的相互作用。数据采用单因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验，使用GraphPad Prism 8.0.1软件进行分析。结果显示，纳米乳平均液滴粒径为117 nm，多分散指数较低，ζ电位为-7.9 mV。抗菌实验表明，其对变形链球菌（Streptococcus mutans）的MIC为0.78 mg/mL，MBC为1.56 mg/mL，并在体外有效清除与抑制生物膜形成。遗传毒性与细胞毒性实验证实该纳米乳在牙科应用中安全性良好。分子对接显示，丁香酚与TNF-α结合亲和力最高，与IL-10结合亲和力较低。本研究凸显了该纳米乳作为牙科抗菌药物的应用潜力，其天然来源及实验验证的安全性为其临床应用提供了支持。

该研究发表于《Odontology》，针对龋病这一全球高发慢性多因素疾病，目前临床常用的氯己定（Chlorhexidine, CHX）虽为牙菌斑控制的金标准，但存在牙齿着色、味觉改变及黏膜刺激等不良反应。为寻找兼具高效抗菌活性与低毒性的天然替代制剂，研究人员以丁香（Eugenia caryophyllus）精油中的主要活性成分丁香酚为核心，构建了纳米乳递送系统，旨在通过纳米技术克服精油易挥发、稳定性差及生物利用度受限等问题，并系统评价其对致龋核心病原菌变形链球菌（Streptococcus mutans）的抗菌与抗生物膜作用机制及安全性。

研究人员采用高剪切搅拌法制备含5%丁香精油的纳米乳，油相由丁香精油与山梨坦油酸酯（Span 80）组成，水相由聚山梨酯80（Tween 80）与超纯水构成。关键技术方法包括：通过动态光散射与激光多普勒微电泳测定纳米乳的平均液滴直径、多分散指数及ζ电位；采用气相色谱-火焰离子化检测（GC-FID）与气相色谱-质谱联用（GC-MS）分析精油化学组成；依据临床与实验室标准协会（CLSI）M07-M09方案，通过肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）与最低杀菌浓度（MBC）；利用结晶紫染色法定量分析生物膜生物量，并通过菌落形成单位（CFU）计数评估活菌数量；采用扫描电子显微镜（SEM）观察生物膜微观结构变化；通过GEMO实验与中性红摄取实验分别评价遗传毒性与细胞毒性；借助Molinspiration Cheminformatics、pkCSM、ProTox-II及OSIRIS Property Explorer平台进行计算机模拟毒性预测；应用AutoDock Vina与AutoDock4软件开展丁香酚与炎症因子（IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α）的分子对接分析。

研究结果如下：

纳米乳表征：制备的丁香纳米乳平均液滴粒径为117±2.6 nm，多分散指数为0.26，ζ电位为-7.9±0.4 mV，pH值为5.56。在25℃、40℃/65%湿度及5℃条件下储存15天，各项理化参数均保持稳定，且精油主要化学成分未发生改变。

抗菌活性：该纳米乳对变形链球菌ATCC 25175的MIC为0.78 mg/mL，MBC为1.56 mg/mL。

抗生物膜活性：在体外生物膜模型中，3.12 mg/mL与1.56 mg/mL浓度分别降低68%（p<0.0001）与25%（p<0.0062）的生物膜生物量；亚抑菌浓度（0.39 mg/mL）可抑制70.7%（p<0.0001）的生物膜形成。CFU计数显示，3.12 mg/mL浓度使生物膜内活菌数降低约20%（p<0.0001）。扫描电镜图像直观显示，经纳米乳处理后，生物膜结构发生明显破坏与脱落。

化合物安全性评价：遗传毒性与细胞毒性实验结果表明，在MIC至4×MIC浓度范围内，该纳米乳未引起显著的DNA损伤或细胞毒性。计算机模拟分析显示，丁香酚符合Lipinski“五规则”，预测最大耐受剂量为1.024 log(mg/kg/day)，无显著肝毒性与细胞毒性，但不同平台的致癌与致突变预测存在差异。分子对接结果显示，丁香酚与TNF-α的结合亲和力最高（AutoDock Vina：-6.1 kcal/mol；AutoDock4：-6.2 kcal/mol），与IL-10的结合亲和力最低，其主要通过疏水相互作用、氢键及π-堆叠作用稳定结合于TNF-α的活性口袋。

讨论部分指出，该研究首次将丁香纳米乳应用于变形链球菌浮游菌与生物膜的联合评价，并结合体外、离体与计算机模拟多层次验证。纳米乳的纳米级粒径与适宜的表面电荷增强了其与细菌细胞膜的接触效率，从而提高了丁香酚的生物利用度与抗菌效能。尽管丁香纳米乳的MIC值高于氯己定，但其天然来源与低毒性特征使其在口腔局部用药中具有独特优势。研究同时指出，体外单一菌种生物膜模型无法完全模拟口腔多菌种复杂生态，后续需开展体内与临床研究以进一步验证其临床转化价值。

结论部分强调，丁香纳米乳对变形链球菌表现出优异的抗菌与抗生物膜活性，且安全性良好，有望成为控制致龋生物膜的新策略，但其临床适用性仍需通过原位与体内实验进一步确认。