来自西伯利亚热球菌（Thermococcus sibiricus）的电子分岔（electron-bifurcating）NfnABC中激发高自旋态（excited high-spin states）、自旋-自旋耦合（spin–spin coupling）以及差异化的[2Fe–2S]+簇温度弛豫的机制启示

《Dalton Transactions》：Mechanistic implications of excited high-spin states, spin–spin coupling, and differential [2Fe–2S]+ cluster temperature relaxations in the electron-bifurcating NfnABC from Thermococcus sibiricus

　　

电子分岔（EB）是一种生物能量转换机制，多个氧化还原（redox）反应在单一酶内发生热力学耦合，使酶能够利用放能过程多余的自由能来驱动吸能过程。由于这种前所未有的化学性质，人们有兴趣将EB原理转化到人工和生物工程系统中，但一个障碍是关于EB酶基本设计原则的知识仍然稀缺。在此，研究人员研究了BfuABC家族EB酶中一个尚未进行光谱表征的成员即来自西伯利亚热球菌（Thermococcus sibiricus）的NADH依赖型还原铁氧还蛋白（ferredoxin）:NADP+氧化还原酶（Tsi NfnABC）电子传递位点的基本物理和电子性质。Tsi NfnABC的冷冻电镜（cryo-EM）结构先前表明其含有十二个氧化还原辅因子：两个黄素（一个FAD和一个FMN）、八个[4Fe–4S]簇和两个[2Fe–2S]簇。FMN、一个[4Fe–4S]簇和一个[2Fe–2S]簇构成了分岔活性位点，称为电子分岔黄素有簇（electron-bifurcating flavobicluster, BF-FBC），其存在于所有BfuABC家族成员中。通过使用电子顺磁共振（EPR）光谱，研究人员识别了源于BF-FBC中FMN自由基和[4Fe–4S]+簇之间相互作用的光谱特征，并观察到BF-FBC的[2Fe–2S]+簇的温度依赖性行为，表明其为中等缓慢的自旋-晶格弛豫（spin–lattice relaxation）。此外，研究人员发现了许多对应于[4Fe–4S]+簇半整数、S > ?自旋态的光谱特征，其中一个可归因于NfnABC特有的[4Fe–4S]簇的赖氨酸配位（lysine-ligation）后果。研究人员将这些发现与电子传递理论以及NfnABC的结构联系起来。这些见解进一步理解了酶如何被设计以控制电子传递来进行热力学挑战性反应。

研究背景与意义：

电子分岔（Electron bifurcation, EB）是生物能量转换的重要机制，能够通过耦合放能和吸能氧化还原反应，使酶可以利用多余的自由能驱动热力学不利的反应，从而在无需ATP水解或离子梯度驱动的情况下实现能量守恒。目前，将EB原理转化应用于人工和生物工程系统具有广阔前景，然而阻碍其发展的关键问题在于，人们对于EB酶的基本设计原则及相关物理电子特性仍知之甚少。在已知的EB酶中，NfnSL的机理相对明确，而属于BfuABC家族的NfnABC酶，其催化电子分岔的具体机制及其内部电子传递（Electron transfer, ET） Relay的物理电子特性则大多未解。西伯利亚热球菌（Thermococcus sibiricus）的NfnABC（Tsi NfnABC）是一种NADH依赖型还原铁氧还蛋白:NADP⁺氧化还原酶，此前的冷冻电镜（cryo-EM）研究已解析其含有12个氧化还原辅因子（包括FAD、FMN、[4Fe–4S]簇和[2Fe–2S]簇）以及独特的电子分岔黄素有簇（BF-FBC）。为了阐明该酶如何进行电子隧穿与控制电子传递，研究人员对其氧化还原位点的物理与电子性质进行了深入光谱学研究。

关键技术方法：

研究人员主要采用连续波X波段电子顺磁共振（Continuous wave X-band electron paramagnetic resonance, CW X-band EPR）光谱技术，对野生型（WT）及K165E突变体的Tsi NfnABC蛋白样本进行了检测。样本分别使用非生理性还原剂连二亚硫酸钠（NaDT）和生理性还原剂NAD(P)H（包括NADPH、NADH以及NADPH+NAD⁺组合）进行还原处理，并在不同温度（如4.5 K、10 K、20 K、32 K、55 K、70 K、200 K等）和微波功率下采集g ～2区域（S = ?信号）及低场区域（S > ?信号和自旋-自旋耦合）的EPR谱图，通过分析谱图形状、g值、温度弛豫行为及Δ|M_s| = 2跃迁等，解析了各铁硫簇及FMN位点的电子结构、自旋态及相互作用。

研究结果：

1. 2.
   结果与分析（Results and analysis）

2.1 连二亚硫酸钠（NaDT）还原的Tsi NfnABC

研究人员使用NaDT对样本进行还原，并在g ～2区域和低场区域收集EPR谱图。

2.1.1 单个[2Fe–2S]⁺簇的检测及簇间自旋-自旋耦合

在g ～2区域，10 K下的光谱显示出源于所有还原簇及自旋-自旋相互作用的复杂信号，而在55 K时，大部分信号变宽消失，留下归属于A1 [2Fe–2S]⁺簇的菱形特征信号（g ～2.02, 1.94, 1.93）。此外，在g ～2区域观察到宽泛的“翼状”特征，并在低场区观察到g ～3.89和3.83附近的Δ|M_s| = 2跃迁，这证明了相邻S = ?簇（如B3–B4或A7–A6）之间存在自旋-自旋耦合，形成了S_eff= 0和1的状态。

2.1.2 高自旋态（High-spin states）

低场EPR光谱显示了半整数S > ?的高自旋态共振信号，由于纯半胱氨酸配位的[2Fe–2S]⁺簇难以 adopting 更高自旋态，这些信号被归属于[4Fe–4S]⁺簇。研究人员观察到了g ～5.9（可能为A3或A2簇的S = 3/2基态）、g ～5.13、10.1和11.8（归属于同一个S = 7/2系统的不同Kramers双重态激发态，具有反转的自旋多重态D < 0）。此外，野生型中显著的g ～5.4宽共振被归属于赖氨酸配位的A7簇的激发高自旋态（S = 5/2或7/2），而在K165E突变体中该信号形状与温度分布发生改变，呈现类似S = 3/2的状态，这证实了A7簇非典型赖氨酸配位对其电子结构的特异影响。

2.2 NAD(P)H还原的Tsi NfnABC

使用生理性还原剂NAD(P)H处理样本，以模拟生理条件下的电子负载与平衡分布。

2.2.1 FMN位点黄半醌（flavosemiquinone）的证据及BF-FBC内FMN位点与还原B1簇之间的自旋-自旋耦合

在NAD(P)H处理的样本中，于g ～2区域检测到了线宽约2.1 mT的强自由基特征，归属于BF-FBC中FMN位点的中性黄半醌。同时，在g ～4附近检测到Δ|M_s| = 2跃迁，证明了FMN黄半醌与邻近（< 7 ?）的[4Fe–4S]⁺B1簇之间存在自旋-自旋耦合。

2.2.2 K165E变体经NAD(P)H处理后的电子负载

由于分离的K165E样本基本呈EPR静默，研究人员得以监测起始于“零点”的顺磁物种生成。NAD(P)H处理后，样本显示S = ? Fe–S信号及FMN黄半醌信号，并同样检测到FMN-B1耦合信号；但未观察到Fe–S位点间相邻的自旋-自旋耦合“翼状”特征。55 K下，除了A1 [2Fe–2S]⁺簇信号外，NADH及NADPH+NAD⁺处理样本还显示出C1 [2Fe–2S]⁺簇（g ～2.007, 1.947, 1.913）及FMN黄半醌的信号，且C1信号可维持至至少200 K。高自旋激发态（g ～5.13, 5.4, 10.1, 11.8）在NAD(P)H处理样本中也同样可被检测。

2.3 g ～2区域的进一步分析

2.3.1 B1 [4Fe–4S]⁺簇

通过比对NAD(P)(H)处理样本的光谱，研究人员将g ～2.038, 1.943, 1.894的共同特征归属于B1簇，与同源蛋白报道值相似。

2.3.2 剩余g ～2共振的不确定性

由于辅因子复杂性，部分g ～2共振仍未归属，可能的候选包括组氨酸配位的A3或B3/B4簇，而WT中g ～2.02–2.03区域较K165E的不明晰，暗示WT的A7簇可能贡献了额外的宽化信号。

讨论（Discussion）：

研究人员将结果置于非绝热电子传递（nonadiabatic ET）框架中，探讨酶对电子传递的控制。自旋-自旋耦合（如FMN-B1、可能A7–A6及B3–B4）的存在表明这些辅因子间具有中等的强电子耦合（electronic coupling, H_DA），几何取向会影响衰减因子（β）进而调控电子传递速率（k_ET）。此外，两个[2Fe–2S]⁺簇（A1和C1）表现出不同的温度弛豫性质，C1（具有CX₄CX₃₅CX₃C基序）因较慢的自旋-晶格弛豫时间可在高至200 K被检测，意味着其具有不同的振动模式，可能影响重组能（λ）与驱动力（ΔG°），且C1的动态构象变化及振动控制可能对EB反应期间C1性质的调节具有重要性。高自旋态（如S = 7/2及A7的S > ?态）在酶活性操作温度（> 350 K）下可能是可及的，并对ET步骤具有机制相关性，可能影响ΔG°和/或H_DA。A7簇独特的赖氨酸配位使其表现出异常宽化的g ～5.4高自旋特征，这种极端构象灵活性及配位动态可能通过调控A7的还原电位，动态影响ET步骤中的ΔG°及λ。

结论（Conclusions）：

研究人员通过对Tsi NfnABC的EPR研究，提升了对这一复杂EB酶内部ET Relay的理解，具体识别出了NfnL-like结构域中A7簇以及BF-FBC所有三个组分（B1、FMN和C1）的光谱特征。这些特征将为未来研究Tsi NfnABC及更广泛的BfuABC家族中EB机制的异同提供必要基础。通过将结果联系ET理论，研究人员确定了未来研究需考虑的辅因子性质，例如A7的赖氨酸配位作用、其他BfuABC酶中高自旋态的功能意义，以及关键C1 [2Fe-2S]簇的慢自旋-晶格弛豫。此外，未来应使用酶变体对不属于A7的高自旋态进行稳健的Fe–S归属，并通过氧化还原滴定确定辅因子的还原电位及其对离散ET步骤的影响。更广泛地，此项关于Tsi NfnABC及其他BfuABC酶如何控制ET的见解，可应用于众多其他含Fe–S簇的酶；共同理解各种能量转换机制中ET控制的范围，对于加强人工和生物工程ET过程的设计原则至关重要。该研究发表在《Dalton Transactions》。