欧洲樱桃实蝇（Rhagoletis cerasi）幼虫与成虫阶段微生物组多样性及潜在生物防治候选类群鉴定

《Entomologia Experimentalis et Applicata》：Diversity of the Microbiomes in the Larval and Adult Stages of the European Cherry Fruit Fly (Rhagoletis cerasi) and Identification of Potential Biocontrol Candidate Taxa

　　

摘要：樱桃实蝇（Rhagoletis cerasi）是全球樱桃（Prunus avium）生产中的重要害虫，可导致果实变色、腐烂及早落，重发区危害率超80%。传统化学农药与农业防控措施面临环境风险高、成本高昂及抗药性演化等局限。昆虫微生物组在昆虫正常及胁迫环境下的生存中发挥关键作用，有益微生物参与营养供给、维生素合成及病原防御，而致病性或失衡的微生物会损害昆虫发育、繁殖及抗病能力，但目前对R. cerasi微生物组的认知仍十分有限。为填补这一空白，研究人员采用宏转录组学技术，对R. cerasi幼虫与成虫阶段的微生物组进行系统性解析与比较，共鉴定到317个个体样本中的DNA与RNA水平微生物类群，其中包括在其他昆虫系统中已被报道具有杀虫或昆虫病原特性的候选类群。结果显示，成虫的非宿主转录本中57.8%归类为微生物来源，而幼虫仅为6.39%，两阶段微生物组成差异显著。在已报道具杀虫/昆虫病原关联的优势细菌类群中，包括荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、昆虫致病沙雷氏菌（Serratia entomophila）、变形沙雷氏菌（Serratia proteamaculans）、球形赖氨酸芽孢杆菌（Lysinibacillus sphaericus）、苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）及类芽孢杆菌属（Paenibacillusspp.），同时还包括禽肠球菌（Enterococcus gallinarum）与铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等其他昆虫关联类群。此外，胞内共生菌沃尔巴克氏体（Wolbachia）在各发育阶段均丰度较高，这与已知其在R. cerasi中的广泛分布一致，并提示其在基于生殖调控的生物防治策略中的潜在价值。本研究首次系统揭示R. cerasi微生物组的组成特征，阐明其发育阶段的特异性差异，并筛选出可用于生物防治开发的候选类群。

欧洲樱桃实蝇（Rhagoletis cerasi）是温带地区甜樱桃与酸樱桃的重要害虫，幼虫在果实内部取食导致品质下降和经济损失，重灾区损失可达20%至80%。现有防控手段依赖化学农药与果园卫生管理，但化学防治易对非靶标生物及生态系统造成负面影响，且长期使用可诱发抗药性，因此亟需开发可持续的生物防治策略。由于该虫幼虫在果实内部隐蔽生活，成虫在树冠活动，两阶段均较难直接接触施用的生物防治剂，使得针对其微生物组的研究成为突破口。昆虫微生物组在营养代谢、免疫防御及环境适应等方面发挥重要作用，但在R. cerasi中的系统研究尚属空白。研究人员在此背景下，采用宏转录组学方法，对土耳其三个地区的自然种群进行幼虫与成虫阶段的微生物组比较分析，以揭示其群落结构、多样性差异及潜在生物防治资源。

在技术方法上，研究人员于2022年6月至7月在土耳其比莱吉克（Bilecik）、托卡特（Tokat）及特拉布宗（Trabzon）采集成虫与幼虫样本，成虫使用黄色粘板配合引诱剂捕获，幼虫从受害果实解剖获得。样本经表面消毒后分组匀浆提取总RNA，构建转录组文库，使用Illumina NovaSeq 6000平台进行高通量测序。数据分析流程包括FastQC质量控制、Trimmomatic修剪接头和低质量序列、STAR比对去除宿主序列、Trinity进行无参考转录本组装，随后采用Kraken 2结合自定义微生物数据库进行物种分类注释，并通过BLASTx验证候选类群的可靠性。Alpha多样性采用Hill数（q₀、q₁、q₂）等指标评估，统计检验采用Mann–Whitney U检验与Welch方差分析。

研究结果分为三部分。第一部分为宏转录组测序数据概况，成虫与幼虫样本分别获得约49 GB与53.2 GB原始数据，过滤后分别保留约141.9 M与154.0 M高质量读段，宿主序列过滤后用于非宿主转录本组装。第二部分检测微生物组成，成虫样本中57.8%的转录本归类于微生物来源，其中细菌占主导（57.5%），优势门类为假单胞菌门（Pseudomonadota），包括假单胞菌科、肠杆菌科及耶尔森菌科等；幼虫样本中仅6.39%转录本为微生物来源，细菌占比5.8%，群落结构简单，Anaplasmataceae（主要为Wolbachia）比例显著升高。真菌、病毒与原生动物在两类样本中占比均不足1%，但存在阶段特异性分布模式。多样性分析显示，成虫物种丰富度（q₀=2846）显著高于幼虫（q₀=1444），但幼虫的香农多样性（q₁=51.45）与逆辛普森多样性（q₂=19.79）更高，表明群落更均衡。第三部分筛选潜在生物防治候选类群，成虫中检出多种在其他昆虫系统中具杀虫活性的细菌，如荧光假单胞菌、昆虫致病沙雷氏菌、变形沙雷氏菌、球形赖氨酸芽孢杆菌、苏云金芽胞杆菌及类芽孢杆菌属，并检测到少量昆虫关联真菌（Fusarium）及病毒（Iflaviridae、Baculoviridae）。幼虫中除高丰度的Wolbachia外，还检出低丰度的荧光假单胞菌与铜绿假单胞菌。

讨论部分指出，R. cerasi微生物组存在显著的发育阶段特异性，成虫阶段微生物多样性高、类群丰富，幼虫阶段则以胞内共生菌为主，群落结构简单且均匀度高。Wolbachia作为常见共生菌，可通过胞质不亲和（cytoplasmic incompatibility, CI）机制用于种群抑制，已有研究证明其在实蝇科害虫防控中的潜力。荧光假单胞菌与铜绿假单胞菌在双翅目昆虫中表现出致病性，但后者因对人具有机会致病性，不建议作为直接应用的生物防治剂。苏云金芽胞杆菌与球形赖氨酸芽孢杆菌已在蚊类等双翅目害虫防治中广泛应用，其对R. cerasi的效果尚需实验验证。由于幼虫在果实内受保护，研究人员建议将生物防治剂的施用重点放在成虫阶段，例如开发含诱食剂的喷洒制剂，以提高摄入剂量。此外，原生微生物组可能与外源病原存在协同作用，影响防治效果，这应在后续研究中加以考虑。

研究结论表明，R. cerasi微生物组在幼虫与成虫阶段差异显著，这种差异反映了食物、环境及生理状态对微生物群落的共同塑造。研究首次系统鉴定了该虫各阶段的微生物组成，并筛选出多个具生物防治潜力的候选类群，为后续分离培养、剂量效应测定及田间试验提供了科学依据。鉴于幼虫隐蔽性高，未来应优先研发针对成虫的高效递送体系，以实现可持续防控。