利用X射线吸收光谱研究锆与基于DOTA的诊疗一体化杂化纳米粒子的相互作用

《Physical Chemistry Chemical Physics》：Investigation of zirconium interactions with a DOTA based theranostic hybrid nanoparticle using X-ray absorption spectroscopy

　　

螯合剂类纳米粒子因其可调控的性质和生物相容性，在诊疗一体化（theranostic)应用中受到广泛关注。其中，AGuIX纳米粒子(NPs)是由聚硅氧烷核心和DOTAGA螯合剂组成的超小型纳米粒子，DOTAGA是DOTA(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)的衍生物，兼具放射增敏和医学成像功能。89Zr是一种极具前景的放射性核素，其在AGuIX纳米粒子上的放射标记效率极高，而Zr-DOTA配合物的形成通常需要加热。理解放射性核素与纳米粒子之间的相互作用对于实现成功的放射标记策略至关重要。X射线吸收光谱(XAS)是能够为溶液中此类纳米粒子提供结构信息的少数实验技术之一。通过结合扩展X射线吸收精细结构(EXAFS)、X射线吸收近边结构(XANES)和理论计算，研究人员比较了Zr-AGuIX纳米粒子与Zr-DOTA中锆的配位化学，解释了AGuIX纳米粒子具有高89Zr标记产率的原因。在Zr-DOTA配合物中，锆采取八配位结构并嵌入DOTA笼中；相比之下，在Zr-AGuIX中，锆并非结合于DOTAGA笼内，而是与来自去质子化硅醇基团和DOTAGA羧酸基团的六个氧原子在更短距离上配位，从而增加了其稳定性。这些发现表明，柔性羧酸基团可有效提高此类硅基纳米粒子的锆放射标记效率。

近年来，纳米粒子技术在医药领域的应用范围不断扩大，尤其在肿瘤诊断和治疗方面展现出巨大潜力。纳米粒子可分为无机纳米粒子（如二氧化硅、氧化铁或氧化金纳米粒子）和有机纳米粒子（如脂质、聚合物胶束、碳纳米管等）。在众多纳米粒子中，二氧化硅纳米粒子因其制备简便、尺寸、孔隙率和形貌可控，以及良好的生物相容性和低毒性，在肿瘤纳米医学领域备受关注。研究人员可通过表面功能化将有机配体接枝到纳米粒子表面，以增强或赋予其肿瘤学相关特性。在核医学领域，杂化（有机-无机）纳米粒子结合医用金属放射性核素（放射金属）如89Zr、111In、64Cu或68Ga的应用日益受到关注。放射金属具有单光子发射计算机断层成像(SPECT)和正电子发射断层成像(PET)应用所需的理想特性。放射标记纳米粒子的优势在于可将不同成像和治疗技术整合到单一纳米平台中，实现协同增效，如将PET的高灵敏度与MRI的高分辨率相结合的PET-MRI双模态系统。在此系统中，稳定的螯合剂对于防止放射金属释放至关重要。

AGuIX（X射线激活与引导）纳米粒子是一种新型放射增敏超小型纳米粒子，目前已获临床批准。其合成采用自上而下的方法：以(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)和正硅酸四乙酯(TEOS)为原料，通过水解-缩聚反应在氧化钆核心周围生长聚硅氧烷壳层，随后将DOTAGA配体[5-(2-氨乙基氨基)-5-氧代-2-[4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]戊酸]接枝到表面。DOTAGA与经典DOTA配体的区别在于其含有一个额外的酰胺功能臂，该臂可通过肽偶联反应将配体连接到纳米粒子。最终产物转移至水中后，氧化钆核心溶解，Gd3+离子被部分DOTAGA配体螯合，形成平均水力学直径小于5 nm的超小型纳米粒子，其聚硅氧烷核心表面存在两种DOTAGA：Gd-DOTAGA配合物和"游离"DOTAGA。此外，源自APTES的伯胺(-NH2)可用于通过肽偶联连接额外螯合剂如去铁胺(DFO)，而硅醇基团(-Si-OH)在pH>2-3时可去质子化形成-Si-O-。

在放射标记纳米粒子中，89Zr作为具有较长半衰期的正电子发射体，在PET显像中具有重要价值。然而，将高度水合的Zr(IV)离子嵌入DOTA/DOTAGA的四氮杂环核心 cage 内具有相当难度。文献报道，Zr(IV)-DOTA配合物的形成需要在水溶液中90°C加热45分钟；若不加热，虽仍可形成配合物，但产率显著降低。Tran等人的研究表明，AGuIX纳米粒子可直接通过可及的DOTAGA基团进行89Zr标记，产率高达96.5%±1.5%，但锆在纳米粒子中的配位环境此前尚不明确。研究人员推测纳米粒子表面的硅醇基团(Si-OH、Si-O-)和伯胺(-NH2)可能促进锆在DOTAGA中的螯合。Chen等人发现，即使无表面接枝配体，锆仍可结合二氧化硅纳米粒子，但这种结合的强度弱于AGuIX。在37°C、pH 7-8条件下反应1小时，96%的锆结合于AGuIX，而未功能化纳米粒子仅为27%。这些结果提示配体在纳米粒子标记中发挥关键作用。理解89Zr在DOTA-聚硅氧烷结构中的螯合机制对于诊疗一体化应用至关重要，尤其是当治疗性放射金属如177Lu同样使用DOTA作为螯合剂时，统一的螯合结构可实现PET显像对放射性配体生物分布的动力学可视化。

然而，表征纳米粒子与放射金属的相互作用并确定表面不同化学基团的作用颇具挑战。X射线吸收光谱(XAS)是能够为溶液中此类纳米粒子提供结构信息的少数实验技术之一，其中扩展X射线吸收精细结构(EXAFS)和X射线吸收近边结构(XANES)可揭示粒子表面金属离子的配位几何构型。

本研究的主要技术方法包括：X射线吸收光谱(XAS)技术，具体为EXAFS和XANES测量，在法国SOLEIL同步辐射加速器MARS光束线（能量2.75 GeV，电流450 mA）上进行，采用双Si(220)晶体单色器和13元素HPGe固态探测器，在荧光模式下采集Zr K边(17,998 eV)数据；密度泛函理论(DFT)计算，使用Gaussian 16软件，采用PBE0泛函和6-31G+(d,p)基组，对H、C、N、O原子进行计算，对锆使用 Stuttgart-Cologne 准相对论有效势(ECP)及其相应基组，通过自洽反应场(SCRF)方法采用极化连续介质模型(IEFPCM)模拟水环境；FEFF 9.05程序进行XANES和EXAFS理论计算，采用实空间格林函数方法，计算至6 ?的R路径长度，并通过DMDW模块从DFT振动频率计算各散射路径的Debye-Waller因子（300 K）；样品制备方面，使用AGuIX@DOTA2%纳米粒子（含2%游离DOTA，其余与Gd3+螯合），以Zr(AcAc)4为锆源，HEPES为生物缓冲液，通过调节Zr:DOTA比例和碳酸根有无制备系列样品。

Zr-DOTA配合物的结构验证：研究人员首先以Zr-DOTA为参考体系。通过DFT计算优化了两种可能的配位结构模型：笼外配位(C1)型[Zr(DOTA)(H2O)4]，其中锆仅与羧酸氧配位并由水分子完成配位层；以及笼内配位(C2)型Zr-DOTA，其中锆嵌入大环 cage 内与四个氮原子和四个羧酸氧配位。EXAFS理论模拟显示，C2型在4-5 ?^-1处出现特征性信号分裂，源于Zr-O(2.14 ?)和Zr-N(2.49 ?)两种不同路径的存在。实验测得的Zr-DOTA EXAFS谱图确实呈现此信号分裂，傅里叶变换(FT)中主峰(1 ?
Zr-AGuIX配位结构的确定：Zr-AGuIX与Zr-DOTA的EXAFS谱图存在显著差异。Zr-AGuIX在4 ?^-1处未出现信号分裂，FT中主峰更窄更强，表明第一配位层仅为单一氧壳层且距离更短，不存在氮原子长距离配位。EXAFS振荡频率低于Zr-DOTA，进一步证实Zr-AGuIX中存在更短的化学键。与Zr-A（锆的HEPES-碳酸根缓冲液，pH 7.2）和Zr-B（同条件加入DOTA配体）对比发现，Zr-A与Zr-B谱图相似，而Zr-AGuIX与之差异显著，说明纳米粒子的加入确实改变了锆的配位环境。简单氧壳层模型拟合结果显示，Zr-AGuIX中Zr-O配位数为5.1±0.8，距离2.10±0.01 ?，优于Zr-A的配位数7.0±1.3、距离2.19±0.02 ?。Zr-O距离的缩短与碳酸根配体被其他配体取代一致，证实了AGuIX纳米粒子对锆配位几何的影响。

XANES分析进一步验证配位结构变化：Zr-DOTA的XANES阈值形状与ZrSiO₄（锆石）相似，为双峰结构且第一峰更强，对应八配位；而Zr-AGuIX的阈值形状更接近钙钛矿型ZrBaO₃，双峰分离且第二峰更强，对应六配位。这确认了Zr-AGuIX中锆的配位数降低。Zr-AGuIX的第一个振荡出现在更高能量处，表明更短的距离。值得注意的是，通过有机路线合成的Zr-DOTAGA与Zr-DOTA的XANES谱图几乎相同，说明DOTAGA额外的酰胺臂不参与锆的配位，锆在两种配体中的化学环境相似，均为八配位笼内结构。

XANES模拟与配位模型构建：研究人员以六配位碱土锆硅酸盐catapleiite [Na₂Zr(Si₃O₉)·H₂O]结构为模型进行XANES模拟，该结构含Zr-O-Si键。模拟谱图与Zr-AGuIX实验谱图较为吻合，支持六配位结构中硅醇基团参与配位的推断。但两谱图第一峰强度存在差异，提示第一配位层中可能还存在氢氧根、水或碳酸根配体。鉴于未功能化纳米粒子中锆的结合较弱（27%），而AGuIX高达96%，研究人员推断接枝配体的羧酸臂参与了锆的配位。

讨论与结论：研究结论部分明确指出，该工作证明了X射线吸收光谱在表征核医学领域放射金属与杂化硅基纳米粒子相互作用中的价值。通过EXAFS、XANES和理论计算相结合，研究人员获得了Zr-AGuIX纳米粒子中锆螯合的结构细节。EXAFS分析表明，锆并未如原先预期那样嵌入DOTAGA笼内；XANES分析确认锆不在DOTAGA四氮杂环核心内，而是当结合纳米粒子时配位数从8降至6。XANES谱图模拟显示去质子化硅醇基团参与了Zr-AGuIX中锆的第一配位层。若四氮杂环 cage 不参与结合，则游离DOTAGA的强羧酸基团应完成锆的配位层，这解释了AGuIX相较于未功能化纳米粒子具有更高89Zr标记产率的原因。这些结果表明，柔性羧酸功能足以提高硅基纳米粒子的锆放射标记效率，对改进纳米粒子放射标记策略具有重要指导意义。