光可调的脱氧核糖核酸相互作用实现胶体的时空组装与弛豫驱动结晶

《Soft Matter》：Light-tunable DNA interactions enable spatiotemporal assembly and relaxation-driven crystallization of colloids

　　

胶体颗粒的自组装能够实现复杂超结构的形成，然而对组装结构的精确控制仍然具有挑战性，且组装路径主要依赖于温度这一全局触发因素。研究人员引入了一种利用接枝于胶体颗粒表面的偶氮苯功能化脱氧核糖核酸链（azoDNA，偶氮苯功能化DNA链）动态调控脱氧核糖核酸介导的胶体相互作用的策略，在时空维度上编程相互作用图景。偶氮苯基团的光致异构化允许对脱氧核糖核酸双链的稳定性进行可逆且连续的调控，从而在等温条件下实现光控的颗粒间结合调控。通过改变光照条件，胶体的有效熔融温度（Tm）可在宽范围内调节，实现可逆组装、空间图案化聚集以及少数颗粒尺度上的胶体结构动态重构。除可逆开关之外，研究人员表明偶氮苯的慢速热弛豫提供了一条新的弛豫介导的胶体结晶路径，其中脱氧核糖核酸黏性的逐渐恢复促进了有序晶体的生长。这些结果展示了如何利用光来编程脱氧核糖核酸介导相互作用的强度和时序演化，为时空控制的自组装和适应性胶体材料提供了一个多功能平台。

胶体颗粒的自组装是一种通用的自下而上方法，可在微米和纳米尺度上创建具有定制性质的多样化超结构。该过程具有自主性，即最终的平衡组装状态被编入单个构建模块之中。颗粒形状和颗粒间相互作用在组装过程中均起着关键作用。为实现成功组装，颗粒间势能必须精确平衡吸引力和排斥力，从而避免动力学捕陷状态，使目标超结构得以形成。

工程化颗粒间势能的有力策略是利用能够进行可编程和可逆相互作用的超分子基元对胶体表面进行功能化。这些基元通过明确的短程分子间相互作用相互结合，当其固定于胶体表面时，在分子尺度上产生的吸引力被有效地传递至胶体尺度。
在众多探索的体系中，表面修饰有精心设计脱氧核糖核酸（DNA）片段的胶体颗粒已成为可编程胶体组装的最强大平台之一，实现了有序晶体和有限尺寸组装体的制备。这些颗粒的组装由末端单链脱氧核糖核酸片段（黏性末端，sticky-ends）间的互补杂交形成双链所驱动。给定序列的两条脱氧核糖核酸链之间分子识别的高度特异性，为通过理性设计脱氧核糖核酸涂层来调控给定胶体间结合强度开辟了途径。基于脱氧核糖核酸的胶体体系因此具有高度可调性，由4至12个碱基组成的黏性末端足以编码广泛的正交相互作用。此外，脱氧核糖核酸功能化颗粒表现出温度响应性组装行为，这种响应性源于驱动脱氧核糖核酸杂交的非共价氢键。仅在足够低的温度下，脱氧核糖核酸双链才稳定，脱氧核糖核酸介导的吸引力主导胶体间势能；当加热超过临界熔融温度（Tm）时，杂交不再有利，导致有效立体排斥和解离。这种热敏行为已被频繁利用以获得动态、可重构和/或可逆的胶体组装体。
尽管脱氧核糖核酸杂交实现了高度特异性结合，但大多数脱氧核糖核酸介导的胶体体系依赖于由序列设计固定的相互作用强度，且只能通过温度进行全局调控。这存在若干限制：首先，分离组装态与解离态的熔融转变通常较陡，仅在狭窄温度范围内吸引力和排斥力才被适当平衡，使颗粒能够访问其平衡构型，即颗粒可在结合状态下扩散的"温度窗口"较窄。这意味着为防止组装缺陷和非期望分形结构的形成，温度控制至关重要，尤其对于易落入动力学捕陷构型的微米至亚微米尺度颗粒。其次，温度作为全局控制参数，阻碍了对胶体相互作用和组装路径的局部或时空控制。

为此，研究人员通过用自互补偶氮苯功能化脱氧核糖核酸链（azoDNA）装饰微米尺度胶体颗粒，扩展了脱氧核糖核酸-胶体工具箱。该方法允许利用光在时空维度上编程颗粒间相互作用图景，不仅通过温度还通过光作为正交触发因素控制其（解）组装。偶氮苯基团是众所周知的分子光开关，可在蓝光（λ=455 nm）和紫外光（λ=365 nm）照射下可逆地在平面反式（trans）和弯曲顺式（cis）构象间转换。顺式偶氮苯向反式基态的弛豫也可通过较慢动力学的热过程实现。一旦掺入脱氧核糖核酸序列的磷酸骨架中，偶氮苯基团即通过其构象状态调控脱氧核糖核酸双链的形成。在分子水平上，平面反式偶氮苯可插入脱氧核糖核酸双链，与链建立π-π相互作用，导致双链稳定化；而顺式异构体因空间位阻有效破坏双链稳定性。Nakasone等近期报告了偶氮苯基团的等温反式至顺式异构化显著增加了脱氧核糖核酸双链的解离速率，使（去）杂交具有光敏性。偶氮苯的引入数量、在序列中的位置以及周围碱基均被证明影响此类azoDNA链在溶液中的光开关行为。

当接枝到纳米颗粒表面时，azoDNA的光响应性可用于调制10-30 nm金纳米颗粒间的相互作用，以创建响应性团簇和图案化纳米晶体。这些开创性研究建立了概念验证，特别关注了利用偶氮苯作为光引导分子开关来开启和关闭颗粒间相互作用的机会。本研究则更详细地探索了将偶氮苯引入模型微米尺度脱氧核糖核酸涂层颗粒（DNA-coated particle, DCP）黏性末端中的效应。研究人员表明，光触发的熔融态与聚集态之间的等温开关可在宽温度范围内实现。azoDNA一旦接枝到微粒表面，其功能不止于简单的开关，混合光照条件下可通过暴露样品来精细调节整批azoDCP（偶氮苯功能化DNA涂层颗粒，azoDNA-coated colloidal particle）的熔融温度。通过改变紫外光与蓝光功率比，可有效调节能够形成稳定双链的脱氧核糖核酸黏性末端覆盖率。通过向样品施加动态和按需的光图案，还展示了颗粒间相互作用的时空分辨控制，接近单颗粒水平的控制。进一步利用此策略纠正组装结构中的缺陷。最后，通过利用顺式偶氮苯向反式状态的慢速热弛豫，研究人员展示了一种弛豫驱动的组装路径，其中颗粒黏性随时间逐渐恢复，实现大型有序胶体晶体的形成。通过热弛豫恢复黏性的时间尺度为分钟至小时量级，而光诱导的偶氮苯异构化可在秒量级内恢复颗粒的黏性。总体而言，该方法确立了光作为局部编程脱氧核糖核酸介导相互作用强度和时间演化的有力手段，为可重构胶体材料中 directing组装路径提供了新策略。

研究人员所用关键技术方法主要包括：采用液相溶胀/去溶胀法将聚苯乙烯-聚乙二醇-叠氮嵌段共聚物（PS-b-PEO-N₃）物理锚定于聚苯乙烯颗粒表面，通过无铜点击化学反应将二苯并环辛炔（DBCO）末端修饰的脱氧核糖核酸链接枝至颗粒，构建含自互补黏性末端（CGCG序列，其中C与G间插入偶氮苯基团）的azoDNA涂层；利用数字微镜器件（DMD）投射空间图案化的紫外-蓝光以调控颗粒间的局域相互作用；通过亮场光学显微镜测量透射光强度变化以监测组装-解组装过程，确定系统的熔融温度；利用偶氮苯的热弛豫动力学与光异构化的差异，设计弛豫驱动结晶路径；采用共聚焦显微镜和扫描电子显微镜表征组装体结构与形貌；通过添加Pluronic F127表面活性剂产生颗粒与基底间的耗尽相互作用，将结晶过程严格限制于二维平面。

**光响应脱氧核糖核酸涂层胶体的构建与表征**

研究人员首先制备了表面修饰有光响应性脱氧核糖核酸的胶体颗粒。聚苯乙烯颗粒（直径0.82 μm或1.00 μm）通过溶胀/去溶胀法功能化，表面接枝聚乙二醇链并通过末端叠氮基团实现与DBCO末端脱氧核糖核酸链的无铜点击偶联。黏性末端为自互补的四碱基序列（CGCG），偶氮苯基团作为侧基插入第一个C和G之间的磷酸骨架中形成azoDNA（C/azobenzene/GCG）。作为对照，非光敏性黏性末端（CGCG）修饰的颗粒称为no-azoDCP，其光敏性对应物称为azoDCP。

通过监测不同温度和光照历史下azoDCP在磷酸盐缓冲液（PBS，[NaCl]=150 mM，pH=7.4）中的组装与解组装行为，评估偶氮苯光开关对颗粒表面自互补脱氧核糖核酸链双链形成的影响。研究团队采用亮场显微镜测定"熔融曲线"——以归一化透射光强度随温度的变化表征系统的聚集状态，低透射对应分散态，高透射对应聚集态，两者间陡峭转变对应的温度定义为系统熔融温度（Tm）。为避免观测对样品的影响，采用远离偶氮苯两种异构体吸收带的红光（~640 nm）进行亮场照明。结果表明，黑暗态（反式富集）azoDCP的Tm为69.8 °C，较no-azoDCP（56.1 °C）升高约14 °C，归因于平面反式偶氮苯通过π-π相互作用插入并稳定脱氧核糖核酸双链；而紫外光照射下（λmax=365 nm，3 mW cm^-2）顺式异构体的空间位阻使Tm降至38.3 °C，产生约32 °C的调控窗口。蓝光照射（λmax=455 nm，10 mW cm^-2）可使Tm恢复至68.1 °C。此等温光控（解）组装过程可逆进行，30个以上循环无明显响应衰减。值得注意的是，蓝光照射态Tm略低于黑暗态（约2 °C差异），提示蓝光亦能促使部分偶氮苯转变为顺式构象。

**混合光照连续调控azoDCP相互作用**

通过同时照射紫外光和蓝光，研究人员实现了对azoDCP相互作用的连续精细调控。紫外光驱动偶氮苯向顺式（弱化杂交）转变，蓝光促进反式（增强结合）转变，两者平衡决定稳态顺反比例及有效脱氧核糖核酸结合强度。随着紫外/蓝光强度比（ψ）从0增至6.5，Tm从68.1 °C逐渐降至53 °C。通过与不同黏性末端覆盖率校准样品的比较，研究人员估算蓝光单独照射下约20%黏性末端失活（顺式状态），紫外-蓝光混合照射下顺式比例最高可达50%。Tm随顺式比例增加呈非线性下降：初始20%顺式引起约2 °C降幅，而后续30%顺式导致约10 °C降幅，表明Tm在高覆盖率时相对独立于覆盖率，仅在低覆盖率时显著依赖之。

利用此特性，研究人员测定了等温光致熔融曲线：在恒定温度（58.5 °C）下线性调节ψ，颗粒在ψ≈2.5时快速解离，回降过程中于ψ≈2.1时重新聚集，呈现源于双链内偶氮苯环境差异导致的滞后现象。

**光控时空（解）组装**

光照的独特优势在于可被精确地时空递送。研究人员将azoDCP分散液（Tsample=47.5 °C）置于图案化紫外-蓝光（数字微镜器件调控）下，首先全视野紫外照射使聚集体解离，随后投射矩形蓝光图案（190×75 μm²）实现局部聚集，再次全视野紫外照射擦除图案。该写入-擦除循环可重复五次以上，展示了系统在微米尺度动态写入、擦除和重构相互作用的能力，空间分辨率接近单颗粒水平。

**单颗粒尺度操控胶体结晶**

利用azoDCP间相互作用的精确时空控制，研究人员实现了缺陷溶解和非目标多晶型的选择性消除。在含3 wt% F127的磷酸盐缓冲液（[NaCl]=51.4 mM）中，颗粒通过耗尽作用被限制于二维平面。初始在49 °C（低于Tm,azo-blue）形成小二维晶粒后，升温至52 °C（略低于晶体熔融温度），选定目标晶粒，以局域紫外光选择性瓦解周围晶粒和非晶聚集体。由于Tsample > Tm,azo-UV，紫外照射区颗粒不具相互吸引力。随后向选定晶粒周边投射动态调整的蓝光图案，使该区域Tm接近Tsample，仅目标晶体生长而抑制额外成核。此选择-生长序列可重复进行以增大晶体尺寸。此外，研究人员以局域紫外光去除了生长晶体中的缺陷富集片段。对具有聚苯乙烯（PS）和聚(3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯)（PTPM）两瓣的Janus颗粒进行位点选择性azoDNA修饰后，其PS-PS补丁间脱氧核糖核酸引导的吸引力驱动形成伪一维胶体纤维。类似地，局部紫外照射可选择性去除纤维的分支点等缺陷。

**热弛豫驱动的偶氮苯顺式至反式异构化介导的结晶**

除快速光开关外，研究人员利用顺式偶氮苯的慢速热弛豫驱动了新型组装路径。将azoDCP在62 °C以ψ=2（紫外=28 mW cm^-2，蓝光=14 mW cm^-2）预处理后置于暗处，初始分散良好的颗粒因热弛豫逐渐聚集并结晶。该过程中，顺-反分布向反式富集的基态弛豫，灭活脱氧核糖核酸链比例下降，Tm上升至超过样品温度时颗粒开始聚集。由于最终10%失活链弛豫时仍能维持颗粒滚动能力，体系得以结晶。相反，55 °C下类似实验（ψ=8）仅产生随机聚集体，因顺式富集刷Tm对少量顺式-反式弛豫高度敏感，"滚动条件"维持时间过短。

研究人员还利用低强度蓝光图案作为精细橡皮擦，在含多晶粒的SU8限域井中选择性保留少数晶粒，经多次"蓝光选留-暗处弛豫生长"循环，获得了直接热退火难以实现的大型晶体。

研究结论部分指出，将偶氮苯引入 tethered 于微米尺度颗粒的脱氧核糖核酸黏性末端，为胶体相互作用提供了动态、光可调的控制方式，实现了等温可逆开关、时空图案化、缺陷校正和弛豫驱动结晶。在暗处或蓝光维持下，偶氮苯主要保持平面反式构象；紫外照射促使其向顺式富集群体异构化。反式偶氮苯通过插入作用稳定双链，顺式则主要通过空间位阻阻止黏性末端间氢键形成而破坏稳定。这种光依赖性的（去）稳定化对颗粒熔融温度产生显著影响，使azoDCP可在等温条件下通过蓝-紫外光切换可逆（解）组装。同时蓝光与紫外光的相对强度可精确调控有效Tm，为胶体组装的全时空控制提供了可能：从数百微米至微米尺度的空间分辨率动态控制azoDCP组装行为，包括重复写入和擦除任意形状团簇、控制各向同性球体的二维结晶、以及操控位点特异性修饰azoDNA序列的各向异性补丁颗粒组成的伪一维自组装纤维。此外，基于偶氮苯的热弛豫，研究人员首次报道了azoDCP暴露于蓝光后允许弛豫至反式富集稳定态的弛豫诱导自组装路径。这种慢速过程与图案化光结合，是按需在熔体中局部形成随机分形聚集体或晶体相的有力工具。光敏颗粒可被局部退火以擦除和纠正已组装结构中的缺陷，取代了温度这类宏观调控手段。这些结果为按需和高空间分辨率操控胶体组装提供了有前景的光基策略，有望用于创建结构明确的定制胶体组装体，以及直接雕刻胶体晶体以创建三维光学晶体波导等可重构材料。